山奈酚通過調控AMPK/Nrf2/HO-1信號通路緩解ox-LDL介導的內皮細胞損傷

康桂蘭 景增秀

(西寧市第二人民醫院，西寧 810003)

血管內皮細胞是維持血管壁正常結構和功能的重要屏障，內皮損傷是動脈粥樣硬化(Atheroscle-rosis，AS)的始動環節[1]。有文獻報道，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopro-tein，ox-LDL)是早期AS發生和發展的重要因素，在AS病灶部位中存在明顯增加的氧化的低密度脂蛋白[2,3]。因此減少ox-LDL對內皮細胞的氧化損傷是預防和治療AS的有效途徑。黃酮類化合物是天然抗氧化劑，能夠緩解脂蛋白的過氧化作用，進而有效地防治AS的發生[4]。山萘酚(Kaempferol)是一種黃酮醇類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、豆類、茶葉中，具有抗癌、抗炎、抗氧化等多種生理作用[5,6]。已有研究表明，山奈酚能夠抵抗缺血再灌注等心血管疾病損傷[7,8]，抵抗AS[9]，但是具體的分子機制并不明確。本研究在體外通過用ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷，進一步探討山奈酚對ox-LDL誘導的細胞增殖、凋亡、炎性因子和黏附分子產生和氧化應激的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 HUVECs購自ATCC；山奈酚購自Sigma公司；MTT試劑盒、annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；核提取試劑盒購于Pierce 公司；RIPA 細胞裂解液、PMSF和BCA 蛋白含量測定試劑購自上海碧云天生物技術研究所；Anti-cleaved-caspase-3、anti-Bcl-2、anti-TNF-α、anti-IL-1β、anti-IL-6、anti-VCAM1、anti-ICAM1、anti-E-selectin、anti-p-AMPK、anti-Nrf2、anti-HO-1和anti-GAPDH等 I 抗購自Abcam公司和Santa Cruz 公司；Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及藥物處理 將HUVECs置于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、5% CO2的培養箱中培養。當細胞生長至80%～90%融合時，用0.25%的胰酶進行消化傳代，分別接種到不同規格的培養板中。藥物處理：先用山奈酚預處理HUVECs 2 h,再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h。

1.2.2siRNA轉染 根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書，分別將Nrf2和HO-1的siRNA轉染到HUVECs。轉染6 h后，更換新的培養基。轉染24 h后，山奈酚處理2 h,再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h。

1.2.3實驗分組 將細胞分為6組：對照(control)組，正常培養；ox-LDL組，100 μg/ml的ox-LDL處理24 h；Kaempferol+ox-LDL組，50 μmol/L的山奈酚處理2 h后再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h；Kaempferol+ox-LDL+compound C組，5 mmol/L的compound C處理2 h，然后50 μmol/L的山奈酚處理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h；Kaempfe-rol+ox-LDL+si-Nrf2組，si-Nrf2轉染24 h，然后50 μmol/L的山奈酚處理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h；Kaempferol+ox-LDL+si-HO-1組，si-HO-1轉染24 h，然后50 μmol/L的山奈酚處理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h。

1.2.4MTT檢測細胞活力 將細胞接種到96孔板上，每組設置4個復孔，分別進行不同處理。然后每孔加入10 μl MTT試劑(0.5 mg/ml)，在培養箱中孵育4 h后棄去培養基，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，震蕩溶解15 min,在酶標儀490 nm處檢測吸光度(A)。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 將細胞接種到6孔板上，每組設置4個復孔，分別進行不同處理。然后經胰酶(不含EDTA)消化，PBS洗滌、離心后，棄上清液。每孔加入500 μl 結合緩沖液重懸細胞，然后加入10 μl annexin V-FITC，5 μl PI，避光室溫孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6ROS含量的測定 將細胞接種到6孔板上，每組設置4個復孔，分別進行不同處理。然后每孔加入10 μmol/L DCFH-DA避光孵育30 min，流式細胞術分析胞間ROS水平。

1.2.7SOD含量測定 根據試劑盒說明書進行SOD含量測定。

1.2.8蛋白提取 將細胞接種到24孔板上，每組設置4個復孔，分別進行不同處理。每孔加入RIPA裂解液與PMSF的混合液(100∶1)裂解細胞15 min，離心收集上清提取總蛋白。根據試劑盒說明書提取核蛋白。BCA 蛋白試劑盒進行蛋白定量。

1.2.9Western blot檢測蛋白水平 取適量樣品蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，采用半干轉方法將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入Ⅰ抗4℃過夜孵育，之后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h。用Odyssey紅外激光成像系統進行掃描。

2 結果

2.1山奈酚提高ox-LDL誘導的內皮細胞活性 山奈酚的化學結構如圖1A所示。MTT試劑盒檢測細胞活力，結果如圖1B所示。與對照組相比，ox-LDL處理顯著降低了HUVECs的細胞活性。當加入不同濃度山奈酚預處理后，細胞活力呈山奈酚濃度依賴性提高。當山奈酚濃度大于30 μmol/L時，細胞活力顯著上升。

2.2山奈酚降低ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡 流式細胞術檢測細胞凋亡，結果如圖2A和2B所示。與對照組相比，ox-LDL處理顯著提高了細胞的凋亡水平。與ox-LDL處理組相比，山奈酚預處理能夠呈濃度依賴性降低細胞凋亡，當濃度大于10 μmol/L時，差異具有顯著統計學意義。我們進一步通過Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達，結果如圖2C、D。與對照組相比，ox-LDL組的cleaved-caspase-3的蛋白水平顯著上調，而Bcl-2的水平顯著降低。山奈酚預處理呈濃度依賴性下調ox-LDL誘導的cleaved-caspase-3的蛋白水平，上調Bcl-2的表達。后續實驗選擇50 μmol/L作為山奈酚的處理濃度。

2.3山奈酚下調ox-LDL誘導的炎性因子表達 Western blot檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達，結果如圖3所示。與對照組相比，ox-LDL處理顯著上調TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。與ox-LDL組相比，山奈酚預處理能夠顯著下調ox-LDL誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6表達。

圖1 山奈酚對ox-LDL誘導的HUVECs細胞活力的影響Fig.1 Effects of kaempferol on cell viability in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

圖2 山奈酚對ox-LDL誘導的HUVECs細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of kaempferol on cell apoptosis in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

圖3 山奈酚對ox-LDL誘導的HUVECs中TNF-α、IL-1β和IL-6表達的影響Fig.3 Effects of kaempferol on expression of TNF-α,IL-1β and IL-6 in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

圖4 山奈酚對ox-LDL誘導的HUVECs中VCAM1、ICAM1和E-selectin表達的影響Fig.4 Effects of kaempferol on expression of VCAM1,ICAM1 and E-selectin in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDLgroup.

2.4山奈酚下調ox-LDL誘導的黏附分子表達 Western blot檢測血管細胞黏附分子(VCAM1)、細胞間黏附分子(ICAM1)和選擇素E(E-selectin)的蛋白表達，結果如圖4所示。與對照組相比，VCAM1、ICAM1和E-selectin的蛋白表達水平在ox-LDL組中顯著上調，而山奈酚預處理能夠顯著下調VCAM1、ICAM1和E-selectin的表達。

2.5山奈酚抑制ox-LDL誘導的氧化應激 如圖5所示，與對照組相比，ox-LDL處理能夠顯著上調ROS的產生，下調SOD的活性。與ox-LDL組相比，山奈酚預處理能夠顯著下調ox-LDL誘導的ROS產生，上調SOD 的活性。

2.6山奈酚通過激活AMPK-Nrf2-HO-1通路抑制氧化應激損傷 Western blot檢測p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白表達，結果如圖6A～C所示。與對照組相比，p-AMPK、Nrf2和HO-1在ox-LDL組中的蛋白水平顯著下降，而山奈酚預處理顯著提高p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平。為了進一步確定AMPK-Nrf2-HO-1通路與山奈酚的保護作用緊密相關，我們用AMPK抑制劑compound C、si-Nrf2和si-HO-1進行處理來抑制該通路蛋白的表達。如圖6A～C所示，與kaempfe-rol+ox-LDL組相比，C.C+kaempferol+ox-LDL組中p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平均顯著下調，si-Nrf2+kaempferol+ox-LDL組中Nrf2和HO-1的蛋白水平顯著下調，p-AMPK表達無顯著變化，而si-HO-1+kaempferol+ox-LDL組中HO-1的蛋白水平顯著下調，p-AMPK和Nrf2表達無顯著變化。這個結果說明AMPK通過調控Nrf2影響HO-1的表達。與kaempferol+ox-LDL組相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1處理組都能夠增加ROS的生成(圖6D)。進一步通過MTT實驗和流式細胞術檢測發現，與kaempferol+ox-LDL組相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1處理組的細胞活力顯著下降，而細胞凋亡顯著增加(圖6E和6F)。這些結果說明山奈酚能夠通過激活AMPK-Nrf2-HO-1通路降低ox-LDL誘導的氧化應激等損傷。

圖5 Effects of kaempferol on oxidative stress in ox-LDL-treated HUVECsFig.5 山奈酚對ox-LDL誘導的HUVECs中氧化應激的影響Note: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

圖6 山奈酚對ox-LDL誘導的HUVECs中AMPK-Nrf2-HO-1通路的影響Fig.6 Effects of kaempferol on AMPK-Nrf2-HO-1 signaling in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group;△.P<0.05 vs kaempferol+ox-LDL group.

3 討論

AS是一種常見的心血管疾病，可由高血壓、高血糖、高血脂、吸煙、飲酒等多種因素引發，嚴重威脅人類健康。血管內皮損傷是AS的主要病理基礎，是一個包括凋亡、炎癥和氧化應激的復雜過程。本研究發現山奈酚能夠緩解ox-LDL誘導的HUVECs損傷，并初步探討了其分子機制，發現山奈酚能夠通過激活AMPK/Nrf2/HO-1信號通路降低氧化應激反應，從而減少內皮損傷。

在正常生理狀態下，內皮細胞的增殖和凋亡保持動態平衡，以此來維持血管的正常功能。研究表明，在AS斑塊中存在廣泛的內皮細胞凋亡，而內皮細胞的過度凋亡是內皮功能障礙的始動環節。在本研究中，我們首先通過MTT實驗檢測細胞活力，發現ox-LDL處理顯著降低了HUVECs的細胞活力。當用山奈酚預處理后，HUVECs的細胞活力呈濃度依賴性提高，說明山奈酚能夠緩解ox-LDL誘導的細胞活力損傷。流式細胞術檢測細胞凋亡，發現ox-LDL處理顯著提高HUVECs的凋亡率，而山奈酚能夠呈濃度依賴性降低ox-LDL誘導的細胞凋亡。我們進一步通過Western blot檢測了凋亡相關蛋白的表達，發現山奈酚能夠呈濃度依賴性下調ox-LDL誘導的cleaved-caspase-3的蛋白水平，上調Bcl-2的表達。以上結果說明山奈酚能夠保護HUVECs抵抗ox-LDL誘導的損傷，且保護作用呈濃度依賴性。

血管內皮的炎性反應在AS的發生發展過程中發揮重要的作用，白細胞向血管內皮的滾動、黏附、遷移和積聚，是血管內皮炎性反應的標志[10]。內皮細胞在外界環境刺激下，能夠誘導多種炎性因子和黏附分子的產生，加速白細胞向內皮細胞的黏附和炎性反應。Jiang等[11]研究顯示，ox-LDL處理HUVECs后，IL-6、TNF-α、VCAM1、ICAM1和E-selectin的含量明顯升高。有文獻指出，山奈酚能夠通過降低炎性因子和黏附因子的表達發揮抗AS作用[12,13]。我們的研究結果與以上結果一致，ox-LDL處理顯著上調了TNF-α、IL-1β、IL-6、VCAM1、ICAM1和E-selectin的表達，而山奈酚預處理使以上蛋白的表達顯著下調。以上結果說明山奈酚能夠保護HUVECs抵抗ox-LDL誘導的炎性損傷。

有文獻報道，細胞增殖凋亡異常以及炎性反應與氧化應激有密不可分的關系。當ROS的生物活性高于抗氧化防御能力時，即產生氧化應激反應。在多種心血管疾病中，例如AS代謝綜合征、血脂異常，ROS水平明顯升高，與疾病的發生發展緊密相關[14，15]。SOD是主要的抗氧化酶，能夠保護機體免受氧化損傷[16]。本研究結果發現，ox-LDL處理能夠顯著上調ROS的產生，下調SOD的表達。山奈酚預處理后能夠顯著下調ox-LDL誘導的ROS產生，上調SOD 的表達，與Xiao等[8]的研究結果一致。這個結果說明山奈酚能夠保護HUVECs抵抗ox-LDL誘導的氧化應激損傷。

Nrf2 是一個調控多種抗氧化酶基因表達的重要的轉錄因子，例如HO-1[17,18]，一種具有抗氧化和細胞保護作用的酶[19,20]。Nrf2/HO-1 信號的激活能夠保護細胞免受氧化損傷。AMPK是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，有研究報道AMPK的活化能夠抑制異常炎癥反應和氧化應激[21]。本實驗的Western blot檢測發現，ox-LDL處理顯著下降p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平，而山奈酚預處理顯著提高了p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平。山奈酚能夠通過提高Nrf2的表達來降低ROS的產生[22],AMPK在癌癥中起到調控作用[23]，為了進一步確定AMPK-Nrf2-HO-1通路與山奈酚的保護作用緊密相關，我們用AMPK抑制劑compound C、si-Nrf2和si-HO-1進行處理來抑制該通路蛋白的表達。與kaempferol+ox-LDL組相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1處理組都能夠提高ROS的生成。進一步通過MTT實驗和流式細胞術檢測發現，與kaempferol+ox-LDL組相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1處理組的細胞活力顯著下降，而細胞凋亡顯著增加。這些結果說明山奈酚能夠通過激活AMPK-Nrf2-HO-1通路降低ox-LDL誘導的氧化應激等損傷。

綜上所述，山奈酚抑制ox-LDL誘導的HUVECs活力降低，減少細胞凋亡，下調炎性因子和黏附分子的表達，緩解氧化應激反應，這與AMPK-Nrf2-HO-1信號通路的激活有關。本研究進一步闡明了內皮損傷及AS的發病機理，為山奈酚防治AS提供了理論依據。

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