基于HPLC指紋圖譜與聚類分析對不同產地連翹質 量 評 價

張洪峰 張學強 于麗霞 陳 晨 王朝宗

（邯鄲市中心醫院，河北邯鄲056001）

中藥連翹為木犀科連翹屬多年生落葉灌木植物 連 翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的 干 燥 近成熟果實或成熟果實的果殼，主要分布于山西、河南、河北、陜西等地，含有苯乙醇苷類、木質素類、環烯醚萜類及黃酮類等多種化學成分[1-2]。聚類分析（Cluster analysis，CA）是一種理想的多變量統計技術，根據一批樣本的多個指標，找出度量樣品之間相似程度的統計量并作為劃分類型的依據。樣品間距離用于衡量所研究樣本之間相似性的程度不同（親疏關系），聚類分析所得到的結果比傳統分類方法更細致、全面、合理。近年來，聚類分析已廣泛應用于中藥及其制劑分析，屬于化學計量學范疇[3]。如袁會瓊等[4]用聚類分析法結合HPLC指紋圖譜鑒別云南重樓和長柱重樓，肖榕等[5]用UPLC結合聚類分析識別不同產地生/制何首烏。連翹含近80種化合物，化學成分較復雜[6]，現行中國藥典靠定量測定連翹苷和連翹酯苷A兩個單體成分進行質量控制，故有必要構建連翹藤藥材的指紋圖譜，全面控制其質量。本實驗擬通過HPLC指紋圖譜結合聚類分析，探討不同產地連翹藥材的質量。

1 材料

1.1 儀器 Shimadzu LC-15C型高效液相色譜儀（Shimadzu公司），包括島津LC-15C泵、SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動進樣器、CTO-15C柱溫箱、島津高效液相色譜LC工作站；BSA224S-CW電子天平（德國，Sartorius公司）；SK250HP型超聲提取器（科導超聲儀器有限公司）；SMART-N15uv超純水機（香港，Heal Force公司）。

1.2 藥材與試劑 連翹藥材采集地及時間見表1，經河北醫科大學生藥學教研室黃蕓教授鑒定為 連 翹Forsythia suspensa （Thunb.） Vahl的 果實。甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；水為超純水；冰醋酸為分析純。連翹苷（批號：110821-201615）、連翹酯苷A（批號：111810-201606）、連翹酯苷B（批號：111811-201603）及蘆丁（批號：100080-201610）均購自中國食品藥品檢定研究院

表1 連翹產地及采收時間

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Shimadzu Wondasil C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱。流動相A：0.3%冰醋酸水溶液，流動相B：甲醇，梯度洗脫以甲醇-0.3%冰醋酸為流動相。梯度洗脫：0～20min，10%→26%B；20～35min，26%→38%B；35～50min，38%→60%B；50～60min，60%→10%B。檢測波長：235nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min。理論塔板數按連翹苷峰計算應不低于5000。

2.2 參照物溶液制備 取連翹苷、連翹酯苷A、連翹酯苷B及蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成一定濃度的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過五號篩）約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取按照2.3項下方法制備的同一批連翹藥材（S7）供試品溶液，連續進樣6次測定，以連翹酯苷A的峰面積和保留時間為參照，對共有峰的相對保留時間和相對峰面積分別進行考察，計算RSD值。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.23%，相對峰面積RSD值均小于1.49%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一批連翹藥材（S7）6份，取按照2.3項下方法平行制備的供試品溶液，分別進樣測定。計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結果表明，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.25%，相對峰面積RSD均小于1.48%，表明實驗采用方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批連翹藥材（S7）的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24h測定，記錄色譜圖。考察共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值。結果顯示，共有峰相對保留時間RSD均小于0.39%，相對峰面積RSD均小于1.77%，表明供試品溶液在24h內穩定。

2.5 指紋圖譜構建及相似度考察 將所收集的連翹藥材樣本分別處理，制備供試品溶液，按照2.1項下方法分析測定，得到各樣本HPLC圖譜，疊加圖見圖1。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）對所獲得的樣本圖譜進行處理，色譜峰自動匹配條件設為：時間窗寬度為0.2s，采用中位數法生成指紋圖譜。連翹指紋圖譜見圖2，其中有共有峰19個。

所獲得的不同產地樣本HPLC圖譜中，14號峰（連翹酯苷A峰）峰面積較大，分離度良好，保留時間適中，故作連翹酯苷A峰為參照物峰。結合參比溶液色譜圖，指認出其指紋圖譜中4個共有峰。

圖1 不同產地連翹藥材的色譜疊加圖

圖2 連翹指紋圖譜（A）和參比溶液色譜圖（B）（13-連翹酯苷B；14-連翹酯苷A；15-蘆丁；18-連翹苷）

表2 20批連翹藥材的相似度

以所獲連翹藥材對照模式為標準，進行相似度計算，結果見表2。由表2可見樣品S18、S20與對照模式差異最明顯，相似度小于0.9。其他樣品與對照模式差異小，相似度大于0.9。2.6 聚類分析 為了直觀評價20批樣品的質量，采用SPSS 22.0系統軟件對樣品共有峰峰面積進行聚類分析，采用組間聯系法，以夾角余弦作為樣品相似性的測度，結果見表3。結果表明，20批樣品基本分為兩大類。圖中顯示聚類趨勢，閾值底層藥材產地較近，隨著閾值增加，氣候與生長條件接近地區連翹聚為一類。聚類分析結果與中藥指紋圖譜相似度評價系統計算的相似度結果基本類似，兩種方法可以相互驗證。

圖3 連翹樣品聚類分析圖

3 討論

中藥指紋圖譜是現在常用的中藥質量控制方法之一，能反映出中藥整體質量信息，體現了中藥作用的整體性和模糊性。聚類分析屬于化學計量學范疇，能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，對數據進行多元分析[5]。連翹是常用大宗中藥材之一，產地多、質量差異大。為建立科學的質量評價方法，我們建立了不同產地連翹藥材HPLC-CA指紋圖譜分析方法，指認了連翹苷、連翹酯苷A、連翹酯苷B及蘆丁等4個有效成分，通過聚類分析，探討了不同產地連翹質量的差異。

連翹所含化學成分復雜，藥材質量受其所含化學成分影響較大，文獻和前期的實驗研究均表明，連翹所含成分受采收時間影響較大[2，7]。我們在收集樣品時，集中收集8月下旬到9月上旬樣品，減少時間差異對樣品質量的影響。

聚類分析作為復雜數據處理的方法，對于中藥多成分質量控制具有較強的應用價值。本實驗中樣本聚類分析距離近，說明含有化學成分及比例相似，質量也較接近。聚類遠近基本表現為地理、氣候等因素差異，可進一步解釋中藥產地道地性的內涵。聚類分析能夠使實驗樣本分組（分類）情況更加直觀地呈現，相似度計算結果呈現的是樣品間差異的定性比較，二者配合使用，能夠使連翹藥材質量標準更加合理，為連翹的臨床合理使用提供科學依據。

[1] 閻新佳，溫靜，項崢，等.連翹的化學成分研究[J].中草藥，2017，48（4）：644.

[2] 劉明，王慧森，李更生，等．河南3地區不同采收期連翹果實和葉中多酚類化合物的累積動態研究[J]．時珍國醫國藥，2017，28（4）：986.

[3] 周磊，楊威，張玉峰.共現矩陣聚類分析的問題與再思考[J].情報雜志，2014，33（6）：32.

[4] 袁會瓊，劉江，段寶忠，等.基于HPLC指紋圖譜鑒別云南重樓和長柱重樓[J].中成藥，2017，39（8）：1670.

[5] 肖榕，林艷，雷思敏，等.UPLC指紋圖譜結合模式識別分析不同產地生/制何首烏[J].中國中藥雜志，2017，42（12）：2305.

[6] 夏偉，董誠明，楊朝帆，等.連翹化學成分及其藥理學研究進展[J].中國現代中藥，2016，18（12）：1670.

[7] 裴香萍，張淑蓉，閆艷，等.不同采收期青翹中連翹苷、連翹酯苷和蘆丁的含量測定[J].中國藥事，2011，25（5）：438.