加味四君子湯對結腸癌模型大鼠AQP-1、VEGF、COX-2表達的影響

李瑞芝 馬浩清 金曉董 陳大貴

（1.海寧市中醫院，浙江海寧314400； 2.海寧衛生學校藥學教研室，浙江海寧314400；3.第二軍醫大學藥學院，上海200433）

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國是第4位最常見的癌癥和致死因素[1]。加味四君子湯是在四君子湯（黨參、白術、茯苓、甘草）的基礎上加入了薏苡仁、藤梨根、白花蛇舌草、石見穿、大血藤等藥物，能益氣健脾、扶正祛邪，近年來在腫瘤防治方面應用廣泛，尤其是在腫瘤晚期正氣虧虛之時，是扶正祛邪的常用良方。研究表明，四君子湯能有效誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長，薏苡仁、白花蛇舌草、藤梨根等藥物也具有一定的抗腫瘤效果[2-5]。本院臨床上將該方應用于結腸癌治療，療效確切，但尚缺乏對該方抗結腸癌作用機制的系統研究。本實驗以二甲肼（1-2dimethylhydrazine，DMH）皮下注射加2%葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）水溶液飲用誘導大鼠產生結腸癌，研究加味四君子湯對結腸癌模型大鼠環氧化酶-2（COX-2）、血管內皮生長因子（VEGF）和水通道蛋白（AQP-1）的影響，探討中藥治療機制。

1 實驗材料

1.1 動物 SD大鼠，60只，雌雄各半，160～180g，6周齡，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物、試劑與儀器 加味四君子湯（海寧市中醫院制備），按配方稱取藥材黨參20g、薏苡仁30g、白術15g、藤梨根30g、茯苓15g、石見穿30g、白花蛇舌草30g、大血藤30g、蜜甘草10g，加入10倍量的蒸餾水煎煮60min，過濾，取濾液，減壓蒸餾濃縮制得水提物，保存備用。鹽酸小檗堿片，上海信誼藥業有限公司，批號22140712。DMH，上海星黍生物科技有限公司；DSS，上海生工生物；AQP-1、COX-2和VEGF酶標免疫試劑盒，上海星黍生物科技有限公司。JA2203A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；光學顯微鏡及顯微攝像系統，OLYMPUS公司；多功能酶標儀，美國Molecular Devices，型號SpectraMax M5。

2 實驗方法

2.1 動物分組 大鼠適應性喂養1周，依據體重隨機分為正常組、模型組、陽性藥物組和加味四君子湯低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 造模與給藥 參照文獻[6]，利用DMH加DSS誘導，預實驗造模成功。造模開始第1周除正常組外所有大鼠給予DMH 40mg/kg頸部皮下注射，隔日1次，共3次；第2周給予除正常組外所有大鼠自由飲用2%DSS水溶液；第3、4周所有大鼠自由飲用自來水和攝食普通飼料。從第4周末開始，加味四君子湯低、中、高劑量組分別予中藥10、20、40g/kg，1mL/100g大鼠體重灌胃；陽性藥物組予鹽酸小檗堿90mg/kg，1mL/100g大鼠體重灌胃。各給藥組分別給藥4周。

2.3 觀察指標 每日上、下午分別觀察1次各組大鼠的一般情況，如毛色、食量、大便性狀、精神活動情況等，每周稱量1次體重并記錄。于實驗第8周，各組大鼠用10%水合氯醛生理鹽水溶液（0.3mL/100g大鼠體重）腹腔麻醉，取血清和直腸組織，ELISA試劑盒檢測外周血中AQP-1、COX-2和VEGF含量，免疫組化檢測結腸癌組織中COX-2和VEGF的表達，各組織切片采用HE染色法進行染色。

2.4 統計學方法 實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件處理，結果以（±s）表示，用ANVOA方差分析進行差異顯著性檢驗。

3 實驗結果

3.1 大鼠一般情況 造模第3周，部分造模大鼠出現腹股溝潰瘍，活動明顯減少，攝食和飲水量下降，皮毛不潔黯淡。給藥第2周后，各給藥組大鼠腹股溝潰瘍開始逐漸痊愈，攝食和飲水有所好轉，精神狀態依然不佳。給藥第4周，部分大鼠出現肛周潰瘍伴有稀便和便血。加味四君子湯低、中、高劑量組和陽性藥物組大鼠上述癥狀輕于模型組。

3.2 各組大鼠實驗期間體重變化情況 造模3周開始，模型組大鼠體重明顯低于正常組（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組能夠不同程度地改善結腸癌引起的大鼠體重增長過慢（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

3.3 各組大鼠干預后血清COX-2、VEGF、AQP-1含量比較 結果見表2。模型組大鼠血清COX-2、VEGF、AQP-1含量均顯著高于正常組（P＜0.01），各給藥組COX-2含量明顯低于模型組（P＜0.05），陽性藥物組VEGF含量較模型組顯著降低（P＜0.01），加味四君子湯中、高劑量組VEGF和AQP-1含量明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。加味四君子湯中、高劑量組COX-2和AQP-1含量與陽性藥物組比較無統計學差異（P＞0.05），VEGF含量明顯高于陽性藥物組（P＜0.05）。加味四君子湯各劑量組之間各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。上述結果初步表明加味四君子湯的治療作用可能與降低血清COX-2、VEGF和AQP-1含量有關。

表1 各組大鼠實驗各時期體重比較（±s） g

表1 各組大鼠實驗各時期體重比較（±s） g

注： 與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△P＜0.05。

體重造模前　　造模1周　　造模2周　　造模3周　　造模4周正常組　10　167.40±7.65　248.70±18.81　289.90±28.86　354.50±31.03　384.00±29.47模型組　10　168.30±9.62　217.50±18.52　265.30±31.81　317.30±36.22#338.30±33.85##陽性藥物組　10　167.50±9.88　218.30±14.32　266.40±12.03　315.50±17.84　339.10±22.17加味四君子湯低劑量　10　166.10±7.85　218.20±11.59　263.20±18.00　308.70±15.61 333.70±18.68加味四君子湯中劑量　10　167.80±4.89　217.90±14.60　263.10±16.66　311.10±18.21　334.00±16.52加味四君子湯高劑量　10　165.90±7.98　219.60±12.21　268.50±17.90　312.20±23.03　334.30±22.34組別　　動物數（只）組別　　動物數（只）體重給藥1周　　給藥2周　　給藥3周　　給藥4周正常組　10　412.20±31.35　433.80±31.70　452.20±31.73　467.00±34.01模型組　10　347.60±46.57##　356.70±46.33##　367.60±52.49##　372.60±18.75##陽性藥物組　10　374.40±26.81　401.20±28.41*　411.70±26.81*　432.20±35.06**加味四君子湯低劑量　10　363.10±23.03　381.60±29.88△　399.50±34.90　412.20±31.23**△加味四君子湯中劑量　10　365.20±20.44　380.60±20.66△　400.80±22.42　417.90±24.61**△加味四君子湯高劑量　10　369.90±34.47　394.30±32.70*　414.90±34.86*　432.10±37.51**

表2 各組大鼠血清COX-2、VEGF和AQP-1含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清COX-2、VEGF和AQP-1含量比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01 ；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與陽性藥物組比較，△P＜0.05。

組別　　動物數（只）　　劑量　COX-2（ng/L）　VEGF（μg/L）　AQP-1（pg/mL）正常組　10　62.50±3.60　127.52±19.11　2.58±0.17模型組　10　82.51±5.76##　165.25±11.79##　3.94±0.15##陽性藥物組　10　90mg/kg　70.39±9.76*　125.85±22.12**　2.97±0.32加味四君子湯低劑量　10　10g/kg　76.47±6.15*　146.48±20.22　3.23±0.34加味四君子湯中劑量　10　20g/kg　70.87±7.53*　141.22±21.17*△　3.01±0.37*加味四君子湯高劑量　10　40g/kg　68.13±13.20*　138.16±15.41**△　2.99±0.34**

3.4 各組大鼠結腸癌組織中COX-2和VEGF表達比較 模型組大鼠腫瘤組織中COX-2、VEGF均呈強陽性表達，而各給藥組陽性表達均有不同程度降低，見圖1、圖2。

4 討論

結腸癌全身癥狀主要為腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發熱，局部癥狀有肛門內脹熱灼痛、便意頻繁、糞便混有黏液及血絲、里急后重、排尿不暢、尿頻，由于其發病周期長，給患者、家庭及社會造成很大負擔[7]。

DMH誘導的大鼠結腸癌變是一個長期、多因素共同參與的過程，其引起的細胞動力學及組織病理學變化和腫瘤形成的分子機制等均與人類的結腸癌形成過程相似，是研究結腸癌形成的良好模型[8]。因此，我們采用改良的DMH+DSS方法誘導大鼠形成結腸癌模型。AQP-1屬于小分子疏水性內在膜蛋白家族，其主要

表達于膽管、膽囊、腎臟、胎盤、大腦和脈絡叢等組織器官中[9]。Moon C等[10]研究發現，在結腸和直腸腫瘤形成的早期階段AQP-1即可被誘導表達。AQP-1與腫瘤

的血管發生與轉移有密切關系，具體表現為對內皮細胞遷移具有促進作用，促進腫瘤血管生成，同時增強腫瘤的侵襲和轉移能力。與野生型小鼠相比，AQP-1基因敲除小鼠體內植入腫瘤的生長速度明顯減慢，因此可利用藥物抑制AQP-1介導的快速水轉運，使內皮細胞因在遷移過程中缺乏局部跨膜離子流而不能形成細胞膜突出，減慢細胞遷移速率[11]。上皮細胞和免疫細胞分泌的各種炎性因子在腸腫瘤形成的過程中起到了關鍵作用，而COX-2在炎癥發生過程中起到重要作用。它作為一種誘導型酶，在正常組織不表達，可由促炎性因子、生長因子、癌基因等誘導表達。Oshima等[12]發現與野生小鼠相比，COX-2基因敲除的APCdelta716小鼠腺癌的數量和大小明顯改善，因此抑制COX-2可有效預防結腸癌。另有研究表明，VEGF主要參與了新生血管和淋巴管的形成，其中新生血管有助于腫瘤生成，進而導致腫瘤轉移。VEGF在結直腸癌中高表達與腫瘤的侵潤和轉移有正相關性，是結腸癌診斷以及預后估計的重要指標[13]。

圖1 各組大鼠結腸癌組織中COX-2表達比較（×200）

圖2 各組大鼠大鼠結腸癌組織中VEGF表達比較（×200）

本研究結果表明，加味四君子湯可降低結腸癌模型大鼠COX-2、VEGF和AQP-1含量，這可能是其治療結腸癌的作用機制。日本學者Soumaoro LT[14]在結直腸癌研究中發現COX-2、VEGF呈正相關性，兩者與腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期密切相關。本研究為加味四君子湯對結腸癌的治療提供了一定的實驗依據，關于加味四君子湯對結腸癌治療作用的其他相關機制，還有待進一步研究。

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