石墨烯-銅納米粒子修飾電極電化學檢測L-半胱氨酸

程原生，劉 敏，吳鎖柱

（1.山西農業大學實驗教學中心，山西晉中 030801；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801）

0 引言

L-半胱氨酸是生物體內一種常見的氨基酸，可參與生物體內許多重要的生化反應，如參與谷胱甘肽的合成及細胞還原過程，具有抗氧化、抗衰老、解毒等功能[1]。L-半胱氨酸也可用于食品加工中，如在面包料中，可促進其發酵、出模，防止老化；在天然果汁中，可防止VC氧化，避免果汁變褐色；在焙烤制品中，是面團改良劑的必需成分，可促進面筋形成等。因此，對L-半胱氨酸的測定具有十分重要的意義。

目前，檢測L-半胱氨酸常采用分光光度法[2]、高效液相色譜法[3-4]、熒光法[5]、酶法[6]等。但這些方法大都操作復雜、價格昂貴、重復性差、選擇性低，不利于快速分析。與上述方法相比，電化學分析法具有成本低、靈敏度和準確度高、分析速度快等優點，所以，國內外已建立多種對L-半胱氨酸含量測定的電化學方法[7-10]。

試驗采用石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極建立一種電化學檢測L-半胱氨酸方法。首先對玻碳電極進行預處理，然后在玻碳電極表面依次修飾石墨烯與銅納米粒子。利用循環伏安法及計時電流法對L-半胱氨酸進行測定，考查了緩沖液pH值對試驗測定的影響。在最優pH值條件下，研究了該修飾電極對L-半胱氨酸的響應性能。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

氧化石墨，選用南京先豐納米材料科技有限公司產品；L-半胱氨酸、蔗糖、硝酸鋁、酒石酸、葡萄糖、亞硝酸鈉、氯化鈣、抗壞血酸、氯化鎂、氯化鐵、氫氧化鈉、高氯酸鋰等試劑，選用上海晶純生化科技股份有限公司產品；試驗用水為去離子水。

1.2 石墨烯-銅納米粒子修飾電極的制作

首先，用粒徑為0.5 μm和0.05 μm的氧化鋁拋光濕粉對玻碳電極（直徑3 mm）預處理，之后在去離子水中超聲清洗3 min；接著，采用之前研究的電沉積法將石墨烯修飾在電極表面[11]；最后，將石墨烯修飾電極浸入0.05 mol/L硫酸銅和0.1 mol/L硫酸鈉混合溶液中沉積銅納米粒子，沉積電位為-1.0 V，沉積時間為120 s，即可制得石墨烯-銅納米粒子修飾電極。

1.3 L-半胱氨酸的測定

將石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極作工作電極、銀-氯化銀電極（3.0 mol/L氯化鉀）作參比電極、鉑絲為對電極，采用循環伏安法及計時電流法對L-半胱氨酸測定。

2 結果與分析

2.1 L-半胱氨酸在石墨烯-銅納米粒子修飾電極上的電化學行為

0.1 mol/L L-半胱氨酸在裸玻碳電極上的循環電流見圖1，0.1 mol/L L-半胱氨酸在石墨烯修飾的玻碳電極上的循環電流見圖2，0.1 mol/L L-半胱氨酸在石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極上的循環電流見圖3。

圖1 0.1 mol/L L-半胱氨酸在裸玻碳電極上的循環電流

圖2 0.1 mol/L L-半胱氨酸在石墨烯修飾的玻碳電極上的循環電流

圖3 0.1 mol/L L-半胱氨酸在石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極上的循環電流

圖1 ～圖3分別為0.1 mol/L L-半胱氨酸（支持電解質為0.1 mol/L磷酸緩沖溶液，pH值7.0） 在裸玻碳電極、石墨烯修飾的玻碳電極及石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極上的循環電流圖。由這些圖可知，與背景信號（虛線）相比，當L-半胱氨酸存在時（實線），在3種電極上均可觀察到明顯的氧化峰。而且，隨著石墨烯、銅納米粒子的依次修飾，獲得L-半胱氨酸的氧化峰電流信號逐漸增大。這些結果表明石墨烯和銅納米粒子成功修飾在玻碳電極表面，且二者共同修飾對L-半胱氨酸的氧化存在協同作用。

2.2 緩沖液pH值的影響

采用循環伏安法研究了石墨烯-銅納米粒子修飾電極對0.001 mol/L L-半胱氨酸在不同pH值（4.0～10.0）的磷酸緩沖液的響應，采集0.8 V處的峰電流值對緩沖液pH值作圖。

緩沖液pH值對0.001 mol/L L-半胱氨酸峰電流的影響見圖4。

圖4 緩沖液pH值對0.001 mol/LL-半胱氨酸峰電流的影響

由圖4可知，隨著緩沖液pH值從4.0升高至10.0，峰電流值呈現先增加后降低的趨勢，且在pH值7.4時達到最大。因此，后續選擇pH值7.4的磷酸緩沖液進行L-半胱氨酸的測定。

lncRNA在肺癌、神經系統腫瘤、消化系統腫瘤及其他腫瘤中調節自噬可以增強化療藥物敏感性、減少耐藥性；在心肌細胞及腦細胞缺血再灌注中，lncRNA通過調節自噬減少細胞凋亡；lncRNA的改變影響了神經細胞的自噬過程，找到了治療神經退行性疾病的新方法；在細菌的感染中，lncRNA調節自噬的過程可能成為根除病原體、抵抗炎癥反應的重要途徑。另外，不僅局限在以上疾病中，還有研究提示，lncRNA通過調節細胞自噬影響治療藥物的敏感性，如胰島素[31]。因此，在更多領域中進一步研究lncRNA調控自噬過程仍有許多挑戰。

2.3 不同濃度L-半胱氨酸的檢測

用計時電流法研究了石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極對不同濃度的L-半胱氨酸的響應（施加電位為0.8 V）。在攪拌狀態下，待背景信號穩定后，將 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0，500.0，1 000.0 μmol/L的 L- 半胱氨酸溶液依次加入背景溶液中（每隔30 s加1次，每種濃度填加5次），記錄電流信號隨時間的變化（圖5）。

L-半胱氨酸在石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極上的計時電流圖（插圖為50～1 000 s時的信號放大圖） 見圖5。

圖5 L-半胱氨酸在石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極上的計時電流圖（插圖為50～1 000 s時的信號放大圖）

由圖5可知，隨著L-半胱氨酸的不斷加入，電流值逐漸增大，響應時間為4～5 s，且電流與濃度在 0～4 443.5 μmol/L及 5 443.5～27 443.5 μmol/L時分別呈現良好的線性關系（相關系數分別為0.994 8，0.993 8），檢出限為2×10-8mol/L。

電流與L-半胱氨酸濃度的線性擬合圖見圖6。

圖6 電流與L-半胱氨酸濃度的線性擬合圖

2.4 重現性

對0.001 mol/L L-半胱氨酸平行測定7次，獲得的峰電流值的相對標準偏差為6.73%，表明該方法的重現性良好。

2.5 選擇性

采用計時電流法考查了同濃度的蔗糖、葡萄糖、氯化鈣、氯化鎂、氯化鐵、硝酸鋁、酒石酸、亞硝酸鈉、抗壞血酸對2×10-5mol/L L-半胱氨酸測定的影響。試驗結果表明，除抗壞血酸外，同濃度的上述物質對L-半胱氨酸的檢測影響可忽略不計，表明石墨烯-銅納米粒子修飾的玻碳電極對L-半胱氨酸的測定具有良好的選擇性。

3 結論

采用電沉積法依次將石墨烯和銅納米粒子修飾到玻碳電極表面，構建了一種基于石墨烯-銅納米粒子修飾電極電化學檢測L-半胱氨酸的新方法。經研究緩沖液pH值對L-半胱氨酸檢測的影響，獲得最佳pH值為7.4。進一步采用計時電流法對不同濃度L-半胱氨酸進行檢測，獲得該方法對L-半胱氨酸的檢測范圍為0～0.027 mol/L，檢出限為2×10-8mol/L，響應時間為4～5 s。該方法具有檢測范圍寬、檢出限低、分析速度快、重現性好、選擇性高等優點。

參考文獻：

[1]劉紅麗，胡慧，周曉東，等.半胱氨酸傳感器的研究進展 [J].分析科學學報，2013，29（2）：271-276.

[2]張一敏，喬月純，李全民.Cu（Ⅱ）為探針-分光光度法測定半胱氨酸 [J].理化檢驗（化學分冊），2012，48（8）：943-945.

[3]靳文仙，閻卉，劉衡，等.高效液相色譜法測定復方半胱氨酸注射液中半胱氨酸的含量 [J].天津藥學，2008，20 （2）：13-15．

[4]王洋，李兆輝，朱海超，等.HPLC法測定蛋白質粉中L-半胱氨酸的含量 [J].中國藥房，2012（29）：2 753-2 754．

[5]楊志廣，任加誠，彭鵬，等．一種半胱氨酸熒光探針的合成及光學性質 [J]．食品工業，2017，38（5）：200-203．

[6]趙銳，戴雯，徐萬州，等．循環酶法檢測血清同型半胱氨酸方法學評價及其在腫瘤診斷中的應用 [J]．檢驗醫學與臨床，2016（24）：3 437-3 439．

[7]姜瑞，楊學梅，王明麗，等．富鎘離子CdS量子點電化學發光法檢測L-半胱氨酸 [J]．分析化學，2017，45（3）：409-415．

[8]袁愛國，李斌，陳健平，等．氧化石墨烯/二氧化鈰-鎳鋁-層狀雙金屬氫氧化物復合材料制備L-半胱氨酸傳感器 [J]．食品科學，2016，37（14）：144-148．

[9]王青，劉衛，羊小海，等．納米金顆粒增強信號的電化學生物傳感器用于谷胱甘肽和半胱氨酸的檢測 [J]．高等學校化學學報，2013，34（8）：1 845-1 850．

[10]王芳，鄭阿萍，王力，等．酸奶中L-半胱氨酸的電化學檢測 [J]．中國食品學報，2012，12（9）：204-208．

[11]吳鎖柱，郭俊杰，韓悌云，等．石墨烯修飾電極電化學檢測食鹽中碘 [J]．山西農業大學學報（自然科學版），2015，35 （4）：441-444．◇