RORα與REV-ERBα在人胃癌組織表達情況及其臨床意義

王小山，祁義軍，俞浩遠，梁 瑞，汪正廣

胃癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤，死亡率位居世界第三位，每年超過700 000例死于胃癌[1-2]，在我國，絕大多數患者在發現病情時均已失去手術根治的機會。因此，探討胃癌的發生與發展機制有利于更好的預測及發現病情，并盡可能尋求更好的藥物治療方案。維甲酸相關孤兒受體(retinoid-related orphan receptors alpha,RORα)與孤兒核受體(nuclear receptor nuclear receptor subfamily 1,group D member 1，REV-ERBα)在人體脂肪、骨骼肌和大腦組織等呈高表達[3]，研究[4]表明，RORα與REV-ERBα調節葡萄糖代謝，炎癥反應，癌癥等多種疾病。國內外文獻[4]關于RORα 與 REV-ERBα 在乳腺癌、肝細胞癌、肺癌等均有研究，但在胃癌方面的研究比較少見。該研究此次運用Western blot和免疫組織化學染色技術檢測RORα與 REV-ERBα在人正常胃組織及胃癌組織中的表達水平，同時分析兩者之間的相關性及其臨床病理意義，使RORα與 REV-ERBα有望成為胃癌治療的靶點和研制化療藥物的理論依據。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2014年行胃癌根治術的50例患者的病理資料及胃癌組織石蠟切片，作為對照，同時收集這50例患者正常胃組織的石蠟切片，該取材取自距離胃癌組織≥5 cm的正常胃上皮組織，患者當中男32例，女18例，年齡35～89(58.4 ± 10.8)歲，術前美國東部腫瘤協作組評分在0～2分，排除術前放化療、精神系統疾病、內分泌功能紊亂、懷孕及肝腎功能疾病，所有參與實驗的患者簽署知情同意書，并獲得安徽醫科大學臨床倫理委員會批準，其詳細數據見表1。

1.2試劑與材料兔單克隆抗體RORα與 REV-ERBα均購自美國Abcam公司；免疫組織化學染色使用的共軛抗體(PV6000)、DAB顯色試劑盒購自北京中山金橋生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的二抗(羊兔抗)、β-actin購自美國Santa Cruz 公司；ECL發光顯影劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學染色 將收集的人正常胃組織及胃癌組織的石蠟切片脫蠟至水，用枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)95 ℃煮沸15 min后自然冷卻至室溫，用PBS沖洗3遍，每次5 min。用3%的H2O2孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶，分別加入RORα一抗、REV-ERBα一抗室溫孵育2 h。 PBS洗滌3次，每次5 min后，滴加對應的共軛抗體(PV6000,兔抗)，再次使用PBS洗滌3次(5 min/次)，使用DAB試劑盒顯色5 min，后用蘇木精復染60 s。PBS及自來水清洗各1次(3 min/次)，吹干。請病理科兩位高年資醫師采用雙盲方式在光鏡視野下找出細胞核，核染色為棕黃色顆粒為陽性(+)，根據高倍鏡下每個視野下染色強度進行半定量，無染色為0分，染色強度≤25%為1分，染色強度為25%～50%為2分，染色強度≥50%為3分，0～2分為陰性(-)，3分為陽性(+),具體統計數據結果見表1。

1.3.2Western blot檢測 將凍存在-80 ℃的人體正常胃組織及不同分期的胃癌組織取出，分別剪碎取0.1 g放入勻漿器中，再加入蛋白裂解液(Tris-HCl、pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%Triton，0.1%SDS，5 mg/ml Leupeptin，1 mmol/L PMSF)1 ml置于冰上研磨，待研磨完全后將勻漿移至1.5 ml離心管中，于-80 ℃及4 ℃中反復凍融3次，使用低溫高速離心機離心30 min(4 ℃、12 000 r/min)，離心后取上清液放入1.5 ml離心管中，用BCA蛋白定量規試劑盒對蛋白提取液進行定量，調整為同一濃度后加入5×蛋白上樣緩沖液，充分混勻后于沸水中煮8 min，放入-80 ℃凍存。取等量的蛋白提取液行SDS-PAGE電泳，待所需目的條帶跑至分離膠中間后將蛋白轉移至PVDF膜上。室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，封閉完成后用含0.05%Tween-20的TBS液清洗PVDF膜3次(10 min/次)，分別加入RORα與REV-ERBα兔單克隆抗體(1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，再次用含0.05%Tween-20的TBS清洗PVDF膜3次(10 min/次)，常溫下用對應的含辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶1 000稀釋)孵育2 h，用ECL發光顯影劑檢測結果，Quantity one 軟件分析顯影條帶灰度值，β-actin作為內參對照。

2 結果

2.1RORα與REV-ERBα在人胃癌組織中的表達量差異RORα與REV-ERBα在人正常胃組織及胃癌組織中的表達差異可以通過免疫組織化學染色技術顯示，RORα在人正常胃組織中的表達明顯高于人胃癌組織，并且隨著TMN分期增長，RORα在人胃癌組織的表達量逐漸減少。見圖1。REV-ERBα在人正常胃組織中表達同樣高于人胃癌組織，并且REV-ERBα表達水平隨著TMN分期增加逐漸減少。見圖2。

2.2RORα與REV-ERBα的表達與胃癌的臨床病理相關分析RORα 在人胃癌組織的表達量與不同患者的年齡、性別、腫瘤大小間差異無統計學意義，但與患者腫瘤的TMN分期(P=0.013)及有無淋巴結轉移(P=0.001)有密切關聯。本研究顯示REV-ERBα在人胃癌組織的表達量也與不同患者的年齡、性別、腫瘤大小間差異無統計學意義，而與患者腫瘤的TMN分期(P=0.010)及有無淋巴結轉移(P=0.002)有密切關聯。見表1。

2.3RORα與REV-ERBα在人胃癌組織中表達的相關性RORα 表達強度為陽性(+)，而REV-ERBα 表達強度為陰性(-)有6例，相反RORα表達強度為陰性(-)，而REV-ERBα 表達強度為陽性(+)有8例，兩者表達強度同為陽性(+)及陰性(-)的患者則分別有10及26例，應用McNemar檢測分析相關性，RORα與REV-ERBα在人胃癌組織的表達呈現正相關性(Kappa=0.377,P=0.007)

圖1 RORα在人正常胃組織及TMNⅠ～TMNⅣ 分期胃癌組織的免疫組織化學染色表達 IHC染色×200

圖2 REV-ERBα在人正常胃組織及TMNⅠ～TMNⅣ 分期胃癌組織的免疫組織化學染色表達 IHC染色×200

項目nRORα表達強度陽性(+)陰性(-)χ2值P值REV-ERBα表達強度陽性(+)陰性(-)χ2值P值性別 男3214180．6430．55717150．2980．768 女18108117年齡(歲) ≤5012570．6750．514660．9650．496 >503821172513腫瘤大小(cm) ≤52411131．9360．25410140．3490．584 >5261791313TMN分期 Ⅰ～Ⅱ11837．2190．013747．5980．010 Ⅲ～Ⅳ391128831淋巴結轉移 有3572812．9630．00153010．8840．002 無1511496

2.4RORα與REV-ERBα在人胃癌組織中的表達差異RORα與REV-ERBα在人正常胃組織及胃癌組織中的表達差異通過Western blot條帶及柱狀圖顯示(圖3A～C)，RORα與REV-ERBα在人正常胃組織中的表達明顯高于胃癌組織，并且隨著TMN分期增長，RORα與REV-ERBα的表達量逐漸減少(P<0.05)。

3 討論

胃癌是多因素參與下具有復雜發病機制的惡性腫瘤。RORα與REV-ERBα均屬于核受體家族，在人體骨骼肌、肝臟、大腦及脂肪組織等廣泛表達[1-2]，且在參與組織表達的過程中存在相似性，RORα與REV-ERBα利用特定的目的基因來調節相關的生理活動，并且以特定的形式結合到靶基因的啟動子反應元件上，從而調控基因的表達[4]。還可以與輔激活因子或輔抑制因子結合形成轉錄復合物，通過組蛋白乙酰化或去乙酰化過程，改變靶基因構象來調控靶基因轉錄[5-6]。進一步研究[6]表明，RORα至少能夠識別REV-ERBs中的一種反應元件,而且作為共轉錄因子一起存在于相同的組織里，RORα與REV-ERBα相互結合調節各組織節律性時，可以通過競爭結合而相互拮抗,RORα常常起到轉錄激活作用，而REV-ERBα起到轉錄抑制作用。研究[7-8]表明，RORα與 REV-ERBα均可以與生物鐘基因(BMAL1)啟動子上結合位點結合，從而參與生命節律調節，同時RORα 與 REV-ERBα 分別可影響白介素-6、環氧化酶-2 炎癥因子，纖溶酶原激活物抑制劑-1蛋白酶抑制劑心功能調節因子，膽固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白等表達水平。增加免疫系統、糖尿病、脂質代謝、心血管疾病等發病的風險。

圖3 RORα 與 REV-ERBα在人正常胃組織、 不同分期胃癌組織的表達水平

A：Western blot檢測RORα 與 REV-ERBα 在人正常胃組織及胃癌組織中蛋白的表達；B：Quantity One 軟件對 RORα 條帶進行灰度值分析；C：Quantity One 軟件對 REV-ERBα 條帶進行灰度值分析；1:人正常胃組織；2：TMNⅠ分期胃癌組織；3：TMNⅢ分期胃癌組織；4：TMNⅣ分期胃癌組織；與人正常胃組織比較：*P< 0.05

在腫瘤研究[9]方面，RORs 核受體家族可調控Th17 細胞的表達,當RORs 活性發生改變，會明顯影響Th17細胞的數量，Th17細胞是自身免疫功能的關鍵因子，參與多種驗證反應及免疫性疾病，對肝癌發病機制具有影響。RORα在可以誘導SEMA3F 基因表達而影響乳腺癌細胞的侵襲能力[10]。REV-ERBs參與調控乳腺癌的侵襲并影響其預后[11]。惡性腫瘤的發生與發展與癌基因及抑癌基因的表達有重大關聯，機體內細胞惡性的增殖是惡性腫瘤的發病基礎，REV-ERBα 可以參與內源性細胞凋亡途徑，REV-ERBα 通過調控BMAL1和COLCK基因的表達，進而激活大量的P73凋亡蛋白，導致相關的凋亡因子(Caspase-3、Caspase-9、Bax及Bcl-2)表達，細胞凋亡呈不可逆性發展[12]。RORα與REV-ERBα參與多種類型惡性腫瘤的發病機制，然而關于消化道惡性腫瘤的文獻比較罕見，因此本研究推測RORα與REV-ERBα共同參與胃惡性腫瘤的發生與發展，并調控其腫瘤細胞的凋亡。

通過免疫組織化學染色實驗結果表明，RORα 與 REV-ERBα 在人體胃癌組織中表達量明顯減少，并且表達水平與人體胃癌組織的臨床病理分化程度、淋巴結有無轉移顯著相關，與患者的年齡，性別，腫瘤大小間差異無統計學意義， 表明RORα與REV-ERBα的低表達可能參與胃癌的發病和疾病發展的過程。 Spearman相關分析示RORα與REV-ERBα在人胃癌組織中的表達呈現正相關性，表明RORα與 REV-ERBα在人胃癌組織中可能存在協同的表達與調控機制。Western blot條帶從蛋白質水平進一步驗證本研究的推測，RORα與REV-ERBα在人體胃癌組織中的表達量明顯下降，并與腫瘤的TMN分期顯著相關。

綜上所述，可以表明RORα與REV-ERBα的表達與胃癌的發生與發展有密切關聯，通過檢測RORα與REV-ERBα的表達情況可能有助于評估患者的胃癌惡性程度、侵襲程度及有無淋巴結轉移情況。總之，RORα與REV-ERBα有望成為腫瘤標志物來進行胃癌的預后判斷及研發新型的化療藥物。

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