AP1S3基因突變與泛發性膿皰型銀屑病的相關性研究

李璐璐 尤家寶 付希安 于功奇 劉 紅 張福仁

泛發性膿皰型銀屑病(generalized pustular psoriasis, GPP)是一種病因不明、危及生命的系統性炎癥性皮膚病。該病常表現為突然、反復發作的高熱、泛發性皮疹及播散性無菌性膿皰，常伴有白細胞和 C反應蛋白升高，嚴重者可累及內臟器官，甚至危及生命[1]。該病的病因和發病機制尚未完全明確，研究已經證實遺傳因素在疾病的發生、發展中發揮重要作用[2]。 2011 年， Marrakchi等[3]最先采用純合子定位與直接測序法發現9個GPP家族均攜帶同一IL36RN 純合子錯義突變，此突變導致 IL36Rα 結構和功能變異從而發生 GPP，使得 GPP 的遺傳研究取得了突破性的進展。2012年，Jordan等[4]首次報道1例歐洲散發GPP患兒的CARD14基因c.413A>C(p.Glu138Ala)突變。我們團隊在2014年也對62例GPP進行了IL36RN基因檢測，發現了2個新的突變位點，這些病例的CADR14基因測序，發現了4個新的突變位點。2個基因在GPP患者群體的突變率分別為46.77%(基因IL36RN)，4.8%(基因CARD14)，顯示GPP的發病具有遺傳異質性[5,6]。最近， Setta-Kaffetzi等[7]首次報道了歐洲膿皰型銀屑病人群中AP1S3基因2個有害的少見突變位點，分別為c.11T>G(p.Phe4Cys)、c.97C>T(p.Arg33Trp)，該發現尚未在其他種群中得到驗證。因此為系統闡釋GPP的遺傳發病機制，探討AP1S3基因是否與中國漢族種群GPP相關，我們收集了2014-2017年在我院住院的107例GPP，對其進行了AP1S3基因測序，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象根據GPP的診斷標準[8]，將2014年1月至2017年2月山東省皮膚病醫院住院患者中確診為GPP的107例納入研究，所有患者病史資料完整。患者皆為中國漢族。其中男60例，女47例，男∶女=1.3∶1。年齡5～76 (35.44±18.02)歲，發病年齡(31.47±18.55)歲，男性患者年齡(33.93±18.73)歲，女性患者年齡(37.06±17.19)歲，二者比較差異無統計學意義(P=0.332)。我們的研究根據是否合并尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris，PV)癥狀,將所有GPP患者分為不合并PV癥狀的GPP(GPP alone)和合并PV癥狀的GPP(GPP with PV)；根據GPP的發病年齡分為兒童型泛發性膿皰型銀屑病(pediatric-onset GPP, PGPP)和成人型泛發性膿皰型銀屑病(adult-onset GPP, AGPP)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA制備 本研究獲得山東省皮膚病醫院倫理委員會批準，在獲得知情同意的前提下，抽取107例GPP患者外周靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝，用TGuide大體積血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周全血DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行。提取后的DNA用全波長紫外/可見光掃描分光光度計ND-8000(NanoDrop公司)測定其純度及含量，要求A260/A280>1.8，根據DNA原液濃度將DNA原液標化為30 ng/μL的DNA模板至96孔板內。

1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR) 擬擴增AP1S3基因(參考號NR_110905.1)的1、2、3、4、5五個外顯子的引物設計序列見表1[7]，由北京華大基因研究中心合成。PCR反應在便攜式PCR擴增試劑盒(2×Taq PCR MasterMix)中進行。反應體系12.5 μL:Taq Mix(為dNTP、Taq酶和緩沖液的混合物)6.5 μL,滅活的去離子水ddH2O 5 μL,引物(F+R)0.5 μL，模板DNA 0.7μL。反應條件：95℃預變性10 min,進行以下35個循環:95℃變性40 s,退火(退火溫度見表1)，72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min。12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。GelRed染色攝片。

1.2.3 DNA測序 將所有陽性擴增條帶的樣本采用乙醇醋酸鈉純化法純化。分離純化后的DNA采用雙脫氧鏈終止法(Sanger 測序法)，在ABI 3500XL DNA測序分析儀(美國Applied Biosystem 公司)上進行基因測序。測序結果與NCBI下載的參考序列同時輸入NCBI Nucleotide BLAST中進行比對分析。測序引物采用各外顯子的上游引物。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析，采用非參數檢驗、t檢驗、χ2檢驗等方法，以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 PCR擴增AP1S3基因外顯子引物序列和退火溫度及產物片段

2 結果

2.1 臨床資料 107例GPP患者中包括無PV癥狀的GPP 31例，男13例，女18例，年齡(31.19±21)歲，發病年齡(23.32±20.43)歲；合并PV癥狀的GPP 76例，男46例，女30例，年齡(36.99±16.57)歲，發病年齡(34.79±16.87)歲。無PV癥狀的GPP及合并PV癥狀的GPP性別構成比差異無統計學意義(χ2=0.028，P=0.876)，GPP alone及GPP with PV發病年齡差異有統計學意義(Z=1.773,P=0.004)。PGPP 31例，男20例，女11例，年齡(15.06±8.77)歲；AGPP 76例，男28例，女36例，年齡(43.57±13.84)歲。PGPP及AGPP性別構成比差異無統計學意義(χ2=3.603，P=0.058)，見表2。

表2 107例GPP患者的基本臨床資料

2.2 AP1S3測序結果 107例GPP患者AP1S3基因所有外顯子進行PCR擴增，擴增片段與所設計的片段大小一致，無非特異性擴增帶。其產物經測序比對后發現，107例GPP患者AP1S3基因5個外顯子中均未發現任何少見突變、低頻突變及SNP位點。

3 討論

GPP是一種少見的危及生命的系統性炎癥性疾病，臨床以突然發生并反復出現的紅斑基礎上粟粒大的無菌性膿皰為特點，可泛發全身，并伴有高熱及全身不適。1910年，Zumbusch首次對該病進行了描述。統計顯示GPP在歐洲及日本國家的發病率為0.6/100萬～0.7/100萬，但中國僅有病例報道，尚無相關數據[9]。在臨床上，根據有無尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris, PV)癥狀，GPP分為單純性GPP(GPP without PV, GPP alone)及伴隨PV癥狀的GPP(GPP with preceding, later or accompanied by PV, GPP with PV)。根據GPP的發病年齡，18周歲之前發病的患者歸為兒童型GPP(pediatric-onset GPP, PGPP)，18周歲之后發病的患者歸為成人型GPP(adult-onset GPP, AGPP)[2]。我們的研究包括107例中國GPP患者，其中包括31例無PV癥狀的GPP(GPP alone)及76例伴隨PV癥狀的GPP患者(GPP with PV)，包括31例PGPP及76例AGPP，不同組別之間性別構成比無差異；少數的無PV癥狀的GPP(GPP alone)患者的發病年齡明顯低于大多數的伴隨PV癥狀的GPP(GPP with PV)患者，與之前的研究結果[10]相符,提示無PV癥狀的GPP可能是GPP的獨特亞型，不同于伴隨PV癥狀的GPP。

GPP的病因和發病機制尚未完全明確，研究已經證實患者的遺傳因素在疾病的發生中發揮重要作用[2]，IL36RN、CARD14基因先后在歐洲種群與中國種群中被證實與GPP發病相關，只有少部分GPP患者攜帶IL36RN或CARD14基因突變，提示該病具有遺傳異質性。最近在2014年，Setta-Kaffetzi等[7]通過對7例Hallopeau連續性肢端皮炎進行外顯子測序，發現AP1S3基因突變，同時他們對256例膿皰型銀屑病(包括72例亞洲GPP患者)進行了直接測序驗證，發現AP1S3基因2個有害的少見突變，分別為c.11T>G(p.Phe4Cys)、c.97C>T(p.Arg33Trp)，基因突變頻率達到5.9%，與3388例正常對照的突變率1.4%相比，差異具有統計學意義(P=2.5×10-7)，但在72例亞洲患者中亦未發現任何突變。隨后，Capon團隊[11-13]對99例亞洲GPP患者(絕大多數為馬來西亞人，具體不詳)AP1S3基因進行了直接測序，未發現突變。2017年M?ssner等[14]研究發現32 864例非法國籍歐洲正常對照AP1S3基因的少見突變等位基因頻率2.3%與51例歐洲GPP患者AP1S3基因的少見突變等位基因頻率2.0%相比無差異。因此對于GPP與AP1S3基因相關性的認識存在諸多爭議。AP1S3基因編碼AP-1蛋白的σ1亞單位的一種異構體σ1C，Sugiura等[11]通過構建三維蛋白模型發現報道的兩處突變可嚴重破壞AP1的穩定性，作者發現敲除AP1S3基因的HaCaT細胞，轉運至內吞體的先天性模式識別受體Toll樣受體3 (TLR-3)明顯減少，導致TLR-3介導信號通路中IFN-β表達顯著下降。IFN-β不僅本身具有抗炎功能還能下調抗炎因子IL-1的表達，從而抑制皮膚炎癥的發生。因此AP1S3基因缺陷干擾TLR-3在細胞質內的轉運，進而抑制其下游IFN-β表達下降，IL-1及IL36Tα細胞因子表達上調，導致皮膚炎癥的發生。本研究中我們對107例中國漢族GPP患者AP1S3基因進行了Sanger直接測序，亦未發現任何少見突變、低頻突變及SNP位點，結合既往研究推測AP1S3基因可能與亞洲GPP患者疾病的發生并無相關性。

我們的研究提供了中國人群GPP患者AP1S3基因測序的結果，但未發現AP1S3基因突變與中國人群GPP的發病相關。結合 Setta-Kaffetzi等[7]、Mahil等[13]及M?ssner等[14]的研究結果，AP1S3基因突變導致TLR-3穩態失衡，進而導致細胞質囊泡轉運障礙從而發生膿皰性皮膚病，但其在各族人群中的發病率及其相關的疾病譜仍需大量的樣本數據支持。膿皰型銀屑病作為一種多基因遺傳疾病，其遺傳模式尚不確定，仍需要開展深入的遺傳學研究，以便為進一步遺傳咨詢、產前診斷和靶向治療藥物研發奠定基礎。

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