軟棗獼猴桃花藥發育過程中主要激素及礦質元素含量特征分析

石 峰，李志軍

（1.兵團第二師林業工作管理站，新疆 庫爾勒841000；2.遼寧省經濟林研究所）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）又名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）、獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉藤本植物，多為野生，主要分布于我國東北、華北、西南及華東各省[1]。軟棗獼猴桃是9種光果獼猴桃種類之一[2]。軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）絕大多數是雌雄異株，但偶有少數是雌雄同株或兩性花，存在性別的多樣性[3-4]。軟棗獼猴桃的雄花、雌花都是形態上的兩性花，生理上的單性花。獼猴桃雄株可育花粉粒量大且均勻飽滿，萌發溝寬而深未及兩端。雌株不育花粉粒量小，外觀不均勻，有些甚至內陷至“帽子”狀，但萌發溝窄，并且萌發溝寬度保持不變[5]。

軟棗獼猴桃果實、根、莖、葉具有止瀉、解煩熱、利尿、祛痰、健胃等作用，對胃癌及腫瘤有一定療效[6]。具有豐富營養成分、保健以及庭園綠化功能的新興水果軟棗獼猴桃具有巨大的發展空間，目前對軟棗獼猴桃的研究多集中在組織培養、資源分布和開發利用與栽培等方面，關于花粉相關研究內容鮮有報道。花粉發育過程是多因素共同作用的結果，在發育的各時期受外部環境、內部生理因素以及大量基因精確調控，是一個極其復雜的過程。針對軟棗獼猴桃小孢子發育過程中內源激素及礦質營養的變化，從生理生化的角度分析軟棗獼猴桃花粉發育特性，研究結果可為其科學合理的栽培管理措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 軟棗獼猴桃花藥中內源激素的測定

1.1.1 試驗材料

供試材料均選擇生長發育正常、管理水平基本一致、長勢一致和花量基本相同的軟棗獼猴桃雌株和雄株作為試驗材料。從5月份開始，分別在不同時期收集雌株和雄株花朵，置冰瓶中帶回，在冰浴條件下用鑷子迅速取花藥，用錫紙包好立即放入液態氮中處理2～3 min，然后將樣品在遮光條件下進行真空冷凍干燥，待樣品充分干燥后密封放入-80℃超低溫冰箱中保存。

1.1.2 試驗方法

植物激素的提取、純化和檢測參照王若仲等的方法進行[7]。準確稱取冷凍干樣品1 g左右（精確到0.1 mg），分4次加入預冷的80%甲醇11 mL（5 mL+2 mL+2 mL+2 mL），在弱光下冰浴中研磨成勻漿，于4℃冰箱中浸提過夜（15 h）。3 000 r下離心（4℃）20 min，倒出上清液，殘渣加入2 mL預冷的80%甲醇后旋渦振蕩5 min，再離心（3 000 r下20 min），倒出上清液，殘渣重復上述操作1次后丟棄，合并上清液加入0.1g PVPP吸附酚類物質和色素，然后3 000 r下離心（4℃）20 min，取上清液得到初提液，旋轉蒸發濃縮近干，然后用1 mL色譜純甲醇溶解殘渣，過0.45 um濾膜，再進行色譜分析。檢測儀器為Agilent1100 LC-Trap.SC，定量分析采用峰面積-標準曲線法定量。試驗結果通過SPSS統計分析軟件進行分析。

1.2 軟棗獼猴桃花藥中礦質元素的測定

1.2.1 試驗材料

供試材料均選擇生長發育正常、管理水平基本一致、長勢一致和花量基本相同的軟棗獼猴桃雌株和雄株作為試材。從5月份開始，分別在不同時期收集雌株和雄株花朵，用鑷子剝取花藥，樣品用水洗凈，再用蒸餾水沖洗，置于80℃恒溫烘箱中干燥24 h，粉碎后備用。

1.2.2 試驗方法

植物礦質元素的提取和檢測參照張敏等的方法進行[8]。準確稱取粉碎樣1 g于瓷坩堝中，在電爐中灰化2 h冷卻，取出，緩慢加入15 mL 20%鹽酸溶浸灰分，小火加熱至近干，取下冷卻，用蒸餾水噴洗坩堝壁，移入100 mL容量瓶中，用重蒸水定容到刻度，搖勻。然后各取上述溶液0.2 mL分別移入25 mL容量瓶中，并加入0.5 mL 10%的氯化鍶溶液，2 mL 2%的氯化銫溶液，用水定容到刻度，搖勻，經原子吸收分光光度法分析。檢測儀器為日立Z-2000系列偏振塞曼原子吸收分光光度計，定量分析采用吸光值-標準曲線法。試驗結果通過SPSS統計分析軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 軟棗獼猴桃不同類型花藥發育過程中主要激素的含量特征

孢子母細胞時期含量較高，隨后下降，在四分體時期含量最低（244.3ng/g），隨著小孢子的發育及有絲分裂的進行又快速上升，并于小孢子單核花粉期達到高峰（740.7ng/g），隨著花粉發育成熟而降低。雌株不育花藥IAA含量變化趨勢與可育花藥基本一致，雄株各個時期IAA含量均高于雌株，除四分體時期差異不顯著之外，其他時期均存在顯著差異（圖1）。可見，小孢子發育過程中需要IAA的參與，在單核花粉期需要較高含量的IAA。

雄株可育花藥ABA含量從小孢子母細胞到四分體時期逐漸增加（1 140.7ng/g），在四分體時期出現拐點，隨著小孢子的有絲分裂而又逐漸下降，雌株不育花藥ABA含量從小孢子母細胞到單核花粉期一直增加，并在單核花粉期達到高峰（2 911.67ng/g）。雄株可育花藥各個時期ABA含量均低于雌株不育花藥，且各個時期含量呈顯著差異（圖2）。尤其是單核花粉期和成熟期2個時期，說明ABA在這2個時期抑制了花粉的萌發。

圖1 花粉發育過程中IAA含量的變化

圖2 花粉發育過程中ABA含量的變化

圖3 花粉發育過程中GA3含量的變化

圖4 花粉發育過程中ZR含量的變化

雄株可育花藥GA3在不同發育時期存在差異，在小孢子母細胞時期含量較高 （372ng/g），隨后下降，在四分體時期含量最低，為356.7ng/g，隨著小孢子的發育及有絲分裂的進行又快速上升，并于小孢子單核花粉期達到高峰（465.7ng/g），隨著花粉發育成熟而降低。而雌株不育花藥各時期GA3含量變化趨勢不大，雄株可育花藥和雌株不育花藥只在花粉母細胞和單核花粉期GA3含量差異顯著，其他時期含量差異不明顯（圖3）。說明在小孢子單核花粉期需要較高含量的GA3發揮一定的作用。

雄株可育花藥ZR含量從花粉母細胞時期（177.7ng/g）一直升高，在單核花粉期達到最大值（550.3ng/g），與其他時期差異顯著，成熟期含量驟降為222ng/g。不育花藥ZR含量在小孢子母細胞時期含量最高（346ng/g），隨后降低，但除花粉母細胞外，各時期差異不顯著。可育花藥ZR含量除花粉母細胞時期低于不育花藥，其他時期均高于不育花藥，且差異顯著（圖4）。可見，小孢子發育過程中需要ZR的參與，在單核花粉期需要較高含量的ZR。

2.2 軟棗獼猴桃不同類型花藥發育過程中礦質元素的含量特征

圖5 花粉發育過程中K含量的變化

雄株可育花藥和雌株不育花藥K含量變化趨勢相反，雄株可育花藥變化趨勢呈W型，而雌株不育花藥變化趨勢呈M型。可育花藥在單核期K含量達到最低值157.9 ug/g，不育花藥K含量在成熟期之前（393.2 ug/g）高于可育花藥（200.3 ug/g），成熟期含量（166.3 ug/g）低于可育花藥（348.3 ug/g）。 可育花藥和不育花藥K含量除在四分期時期差異不顯著外，其他時期差異顯著（圖5）。

雄株可育花藥Mg含量在單核期含量最低，為42.9 ug/g，其他時期含量差異不顯著。不育花藥在成熟期Mg含量達到最低值，僅27.7 ug/g，其他時期含量差異不顯著。雄株可育花藥單核期Mg含量顯著低于不育花藥，而成熟期可育花藥Mg含量顯著高于不育花藥（圖6）。

雄株可育花藥Ca含量呈現上升的趨勢，在成熟期達到最高值（138.5 ug/g）。雌株不育花藥Ca含量變化趨勢呈M型，花粉母細胞時期至四分體時期Ca含量上升，并在四分體時期達到最大值153.7 ug/g。不育花藥各時期Ca含量均高于可育花藥，在四分體時期差異顯著（圖7）。

雄株可育花藥Fe含量變化趨勢呈W型，在四分體時期含量最低為2 ug/g，單核花粉期含量達到最大值37.7 ug/g。雌株不育花藥Fe含量花粉母細胞時期含量最低（0.7 ug/g），在四分體時期達到最大值13.8 ug/g，隨后降低，成熟期已經檢測不到其含量。雄株可育花藥Fe含量和雌株不育花藥Fe含量相比在各個時期差異顯著（圖8）。

圖6 花粉發育過程中Mg含量的變化

圖7 花粉發育過程中Ca含量的變化

圖8 花粉發育過程中Fe含量的變化

可育花藥和不育花藥微量元素Zn變化趨勢不明顯，但在單核期Zn含量表現出明顯差異，單核期可育花藥Zn含量（3.6 ug/g）高于不育花藥（0.5 ug/g）（圖9）。

可育花藥和不育花藥微量元素Mn變化趨勢不明顯，但在四分體時期和單核期Mn含量表現出明顯差異，四分體時期不育花藥Mn含量為2.6 ug/g，單核期為2.7 ug/g，均高于可育花藥（1.0 ug/g和1.1 ug/g）（圖10）。

3 討論與結論

植物激素作為植物體內的微量信號分子，控制著植物的雄蕊發育進程。一些擬南芥激素不敏感型突變體表現為雄性不育[9]。IAA含量高的組織和器官是營養物質的輸入庫，在調節養分競爭方面起著重要作用，低的IAA含量使花粉母細胞可能處于營養饑餓狀態[10]。本試驗發現雌株不育花藥從花粉母細胞開始IAA含量顯著低于雄株可育花藥。這一結果與上述研究結果一致。Singh等認為，激素含量的升高或降低直接誘發大多數植物產生雄性不育[11]。何鋼等發現冬棗花藥一開始ABA含量就很高，可能促使花粉母細胞死亡[9]。但本試驗發現，可育花藥和不育花藥ABA含量在花粉母細胞時期差異不顯著，隨著花粉發育進程，經過四分體和單核期，差異達到顯著水平。可能因為ABA含量在達到一定值后抑制了花粉發育的進程，導致了雌株花粉不育的發生。已知GA3能增強植物細胞壁的伸展性，促進細胞的伸長和體積的增大，細胞分裂素類主要作用是促進細胞分裂和組織分化。前期花粉掃描結構發現，不育花粉在形態上不飽滿，超微結構發現外壁沒有基粒棒的形成。本試驗結果也發現，單核期不育花粉GA3含量低于可育花粉，而且可育花藥ZR含量除花粉母細胞時期低于不育花藥，其他時期均高于不育花藥，且差異顯著。

圖9 花粉發育過程中Zn含量的變化

通過對軟棗獼猴桃可育孢子和不育孢子發育四個主要時期內（小孢子母細胞、四分體時期、單核期和成熟期）主要5種激素（IAA、ABA、GA3、ZR和ZT）含量變化的分析可知，雖然5種激素在花粉發育過程中含量和變化趨勢各有不同，但在單核期其含量都達到最大值或其最低值，且可育花藥和不育花藥之間含量在此時期內差異水平基本呈顯著水平。前期對可育和不育花藥的組織解剖學研究發現，在絨氈層細胞代謝異常的的同時，由于雌株的四分體小孢子在胼胝質解體后，沒有經有絲分裂而停留在單核狀態，也導致了雌株小孢子的不育。這可能說明，5種激素在單核期含量的表現導致了物質的供應和生理代謝活動發生了紊亂，引起了小孢子在形態學上不能進行有絲分裂，最終導致了敗育的發生。各激素在成熟期和單核期含量的變化也可能是與此生理活動相適應的結果。

圖10 花粉發育過程中Mn含量的變化

植物激素對雄性不育的發生具有重要調節作用，但由于作物不同，或作物相同但所用材料不同或雄性不育類型不同，所得結果存在一些差別。對油菜、白菜、辣椒、水稻和蘿卜等多種作物雄性不育材料研究結果表明，就每一種激素而言，均存在2種相反的報道結果[12-16]。因此激素如何以極其微量的成分調控植物生長、發育及其對環境適應的機制，以及如何合理利用激素對植物生長進行有目的的調控都有待于深入研究。

通過對軟棗獼猴桃可育孢子和不育孢子發育4個主要時期內（小孢子母細胞、四分體時期、單核期和成熟期）3種大量元素（K、Ca和Mg）以及3種微量元素（Fe、Mn和Zn）含量變化的分析可知，雖然6種礦質元素在花粉發育過程中含量和變化趨勢各有不同，但除Mg外，可育花藥和不育花藥之間含量在花粉母細胞時期、單核期以及成熟期差異達顯著水平。礦質元素與植物正常的新陳代謝、正常發育有著密切的關系，它們有的是酶的活性因子，起著激活酶的作用，有的參與激素的生理作用，促進激素發揮作用[17]。因此在軟棗獼猴桃雌株和雄株花藥發育的過程中，礦質元素直接或間接的參與到花粉育性的生理調控中去。

植物花粉要經歷一系列形態和生理生化的變化，這期間任何一個過程受到直接或間接的影響都可能會導致小孢子不育的出現。K和Mg作為酶的激活劑，糖酵解、蛋白質的合成以及核酸的代謝都需要其參與，在碳水化合物代謝、呼吸作用及蛋白質代謝中起重要作用[18]。可育花藥從單核期到成熟期這一過程中含量增加，而不育花藥在這一過程含量減少。花粉發育過程中對細微的生理生化變化都十分敏感。不育花藥K和Mg含量的減少必然對小孢子的發育產生影響。Ca能保持細胞結構以及膜上蛋白的穩定性，同時作為第二信使參與調節生殖生長[19]，此外，其在細胞程序性死亡的重要作用也已經被認識并受到重視[20]。通過前期可育花粉和不育花粉的觀察，以及不育花藥發育過程中Ca含量一直高于可育花藥，可能在細胞程序性死亡方面調控獼猴桃雌株小孢子的敗育。Fe能形成螯合物，在酶系統中作為CAT、POD、細胞色素氧化酶等酶系統的輔基，影響電子傳遞、呼吸鏈、光合鏈等[18]。可育花藥從單核期含量達到最大值，而不育花藥在這一過程含量開始減少直至消失。可見Fe在雌株花粉敗育過程中發揮了一定作用。Zn作為鋅指蛋白的組成成分，參與調控遺傳物質的活動，從而影響基因的表達[21]。現已從矮牽牛中克隆了一系列花藥特異表達或優先表達的鋅指蛋白基因，其中ZPT3-2主要在花藥的絨氈層組織中表達，從四分體小孢子期開始一直持續到絨氈層的降解；ZPT4-3、ZPT3-1特異地在小孢子單核期表達[22]，這與本試驗結果一致。Mn是形成葉綠素和維持葉綠素正常結構的必需元素，與光合和呼吸作用均有關系，Mn還是硝酸還原的輔助因素，缺Mn時植物合成氨基酸和蛋白質受阻[18]。試驗結果可知，可育花藥單核期和成熟期Mn含量保持不變，而不育花藥從單核期到成熟期含量減少，差異顯著，可能與從單核期到成熟期氨基酸和蛋白質合成受阻有關。

雌株不育花藥IAA含量顯著低于雄株可育花藥。可育花藥和不育花藥ABA含量隨著花粉發育進程，經過四分體和單核期，差異達到顯著水平，ABA含量在達到一定值后抑制了花粉發育的進程，導致了雌株花粉不育的發生。單核期不育花藥GA3含量低于可育花粉，而且可育花藥ZR含量高于不育花藥，且差異顯著。低含量的細胞分裂素類抑制了細胞分裂和組織分化，從而導致了小孢子的敗育。可育花藥和不育花藥之間礦質元素含量在花粉母細胞時期、單核期以及成熟期呈顯著水平。

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