反式肉桂醛與溫和加熱結合對復原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺作用

石 超，郭 都，張文婷，郭凱倫，溫啓吾，劉志遠，孫慧慧，陳 珊，孫 正，郭 曉，尹術華，夏效東*

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種周生鞭毛、無芽孢的棒狀革蘭氏陰性菌[1]。它可引起新生兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎，并可造成早產兒和低體質量新生兒的死亡[2]。對于感染的嬰幼兒，死亡率高達40%～80%[3]，并且，20%的感染嬰幼兒會患有嚴重的神經后遺癥，如腦積水、四肢麻痹和智力發育遲緩等[4-5]。

研究表明，嬰幼兒乳粉是世界范圍內嬰幼兒攝取營養的主要途徑[6]。然而，嬰幼兒乳粉并不是一類無菌的產品，它含有致病菌并有可能導致疾病[7]。嬰幼兒乳粉是阪崎克羅諾腸桿菌傳播的主要途徑[8]。嬰兒缺乏完善的免疫系統和穩定的腸道菌群，因而更易被阪崎克羅諾腸桿菌感染。因此，食用前控制嬰幼兒乳粉的微生物特別是阪崎克羅諾腸桿菌污染尤為重要。

盡管針對嬰幼兒配方乳粉的優良制造標準已發布，但是保證嬰幼兒乳粉無菌還是非常困難。為減少嬰幼兒乳粉中的微生物風險，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）在2007年建議嬰幼兒乳粉使用70 ℃的熱水沖調并快速冷卻至適宜食用的溫度[9]。但是，使用如此高溫度的熱水沖調乳粉不被父母廣泛接受[10]。高溫會導致乳粉中的一些熱敏感物質損失[11]，如對熱敏感的維生素、乳鐵蛋白等；并且，高溫沖調也會增大燙傷的風險并且不方便嬰幼兒直接食用。近年來，部分研究者將目光投向于在食用前的沖調過程使用溫和加熱與天然物質結合來控制殺滅微生物[12-15]。

反式肉桂醛是肉桂樹皮提取物中的主要活性物質，已被美國食品藥品監督管理局評價為公認安全的食品成分（批準文件序號21 CFR 182.60）。反式肉桂醛已被報道對多種食源性致病菌有抑制作用，研究表明它能夠抑殺蘋果汁及蘋果酒中的大腸桿菌O157:H7[16]，抑制牛奶中的大腸桿菌并且能夠抗牛奶氧化[17]，抑殺西紅柿上不同血清型的沙門氏菌[18]，并且，反式肉桂醛還被報道有抗癌、抗炎、治療糖尿病、降低細菌耐藥性等多種生物活性作用[19]。

本研究采用反式肉桂醛與溫和加熱結合處理復原嬰幼兒牛乳，探討該方法對復原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺效果。并分別利用LIVE/DEAD?細菌活性檢測試劑盒和場發射掃描電子顯微鏡探究二者結合作用對阪崎克羅諾腸桿菌細胞膜完整性及細胞形態的影響，試圖闡述其可能的抑菌機理，為反式肉桂醛與溫和加熱結合應用于復原嬰幼兒牛乳及其他食品中抑殺阪崎克羅諾腸桿菌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544購于美國模式菌株收集中心。阪崎克羅諾腸桿菌分離菌株14-15和18-8由西北農林科技大學食品科學與工程學院食品微生物研究團隊分離自市售嬰幼兒乳粉。

反式肉桂醛（色譜級，純度≥99%） 美國Sigma公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB） 北京陸橋技術有限公司；LIVE/DEAD?BacLightTM細菌活性檢測試劑盒 美國賽默飛世爾科技公司；其他所用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GHX-9050B-2細菌培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司；Smart SpecTMplus分光光度計 美國Bio-Rad公司；5804R低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Spectra Max M2多功能微孔板檢測儀 美國Molecular Devices公司；S-4800場發射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 混合菌懸液的制備

將凍存于-80 ℃的阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544、14-15和18-8采用劃線法在TSA平板上活化，分別挑取單菌落接種于30 mL TSB中，將3 瓶TSB置于37 ℃、120 r/min振搖培養18 h，培養后的菌液分別離心（5 000×g、10 min、4 ℃）并去除上清液，用pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體沉淀，反復2 次洗滌后，使用一定量的PBS懸浮菌體沉淀，測定并調整菌懸液的OD600nm為0.5，使菌懸液濃度約為108CFU/mL。取相同體積的3 種菌懸液混合制備為混合菌懸液（濃度約為108CFU/mL）。

1.3.2 復原嬰幼兒牛乳的制備

市售嬰幼兒乳粉購買于陜西省咸陽市楊凌區好又多超市。按照商品標簽沖調復原嬰幼兒乳粉，將25.5 g乳粉溶解于180 mL無菌水中，搖勻后置于63 ℃水浴30 min進行巴氏殺菌[20]，冷卻至室溫后備用。

1.3.3 阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌作用

將復原嬰幼兒牛乳加入試管（10 mL），向各組接種100 μL三種阪崎克羅諾腸桿菌的混合菌懸液，使復原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌的濃度約為6.5～7.0（lg（CFU/mL）），同時向樣品中添加反式肉桂醛溶液（溶劑為含0.5% DMSO的無菌水），使反式肉桂醛溶液的質量分數分別為0.4%、0.3%、0.2%和0.1%（下同），將不添加反式肉桂醛的樣品（含有0.5% DMSO）作為對照組。實驗室前期結果表明1% DMSO在復原嬰幼兒牛乳中不會影響阪崎克羅諾腸桿菌的活性。將接種后的樣品置于4 個不同的溫度（25、45、50、55 ℃）保溫殺菌。將25 ℃和45 ℃的樣品分別保溫殺菌0、20、40、60、90、120 min，50 ℃和55 ℃的樣品分別保溫殺菌0、10、20、40、60、90 min后，將樣品直接或用PBS 10 倍稀釋后，涂布到TSA培養基上37 ℃恒溫培養24 h，記錄細菌總數，實驗每組設置3 個平行。

1.3.4 阪崎克羅諾腸桿菌細胞膜完整性的測定

溫和加熱與反式肉桂醛結合作用對阪崎克羅諾腸桿菌細胞膜完整性影響的測定，參考Shi Chao等[21]所采用的LIVE/DEAD?細菌活性試劑盒方法。試劑盒中含有SYTO 9及碘化丙啶（propidium iodide，PI）兩種核酸染料。SYTO 9染料能夠穿透完整及受損的細胞膜，將所有細菌染色為綠色。相反，PI僅能穿透受損細胞膜，將細胞膜受損的細胞染色為紅色，并降低SYTO 9的綠色熒光。因此，當在細菌懸液中添加SYTO 9與PI兩種染料時，細胞膜完整的菌體呈現綠色，細胞膜不完整的菌體呈現紅色。為探究結合作用對阪崎克羅諾腸桿菌的抑制機理，我們選擇ATCC 29544菌株進行后續的研究。將37 ℃振搖（120 r/min）培養18 h的阪崎克羅諾腸桿菌離心（10 000×g、15 min、4 ℃）棄去培養液，將菌體沉淀溶解于2 mL的0.85% NaCl溶液中。分別取1 mL菌懸液加入20 mL 0.85% NaCl溶液和20 mL 70%異丙醇溶液并置于室溫孵育1 h（每15 min輕柔振搖1次），從而得到活細胞和死細胞懸液。隨后將兩管菌懸液離心（10 000×g，10 min），使用0.85% NaCl溶液將活細胞和死細胞沉淀重新懸浮并制備為活細胞和死細胞混合溶液，使活細胞的比例為0、10%、50%、90%和100%。

在無菌的離心管中加入活細胞樣品，按照處理條件不同將菌懸液分為4 組：對照組（25 ℃處理）、單純反式肉桂醛組（0.2%反式肉桂醛+25 ℃處理）、單純溫和加熱組（50 ℃處理）和結合作用實驗組（0.2%反式肉桂醛+50 ℃處理），每組3 個平行。將樣品處理后離心（11 000×g、1 min）并使用0.85% NaCl重懸浮。將100 μL標準樣品及實驗樣品加入黑色96 孔酶標板中，將SYTO 9和PI混合染料加入每孔并輕柔混合。將樣品置于25 ℃避光孵育15 min，隨后使用多功能酶標儀檢測熒光強度。綠色熒光染料SYTO 9的激發、發射波長分別為485、542 nm，紅色熒光染料PI的激發、發射波長分別為485、610 nm。通過檢測不同活細菌比例標準樣品（0、10%、50%、90%和100%）的綠色熒光強度，構建綠色熒光強度與細胞膜完整細菌（活細菌）百分比之間的線性關系。檢測實驗組的綠色熒光強度，根據本研究測定的綠色熒光強度與細胞膜完整細菌百分比之間的擬合方程，計算出細胞膜完整細菌百分比。

1.3.5 阪崎克羅諾腸桿菌細胞形態的觀察

反式肉桂醛與溫和加熱結合對阪崎克羅諾腸桿菌細胞形態的影響參照Li Guanghui等[22]利用場發射掃描電子顯微鏡的方法。將37 ℃、120 r/min振搖培養18 h的阪崎克羅諾腸桿菌離心（5 000×g、15 min、4 ℃）并棄去TSB培養液，使用TSB將菌體沉淀重新懸浮。將菌懸液分為4 組，同1.3.4節，將樣品分別培養1 h或2 h。隨后將菌體離心并使用PBS清洗兩次，使用含有0.25%戊二醛的PBS 4 ℃固定細胞。12 h后將菌體離心（5 000×g、10 min、4 ℃）并使用PBS及無菌水分別清洗菌體1次，隨后使用含有1%鋨酸的PBS于4 ℃固定細胞5 h后，將菌體離心（5 000×g、10 min、4 ℃），并使用不同體積分數的無水乙醇（30%、50%、70%、80%、90%和100%）梯度洗脫細胞，每次10 min。將菌體滴加至潔凈的玻片表面進行干燥后噴金處理，使用場發射掃描電子顯微鏡觀測細胞形態。

1.4 數據統計分析

所有實驗重復3 次，結果以 ±s表示。使用SPSS 19.0軟件，對實驗數據進行統計分析。采用ANOVA對結果間的顯著性進行比較，不同處理間P＜0.05認為差異顯著，P＜0.01則認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌效果

圖1 反式肉桂醛結合溫和加熱對復原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌數量的影響Fig. 1 Effect of combined treatment with trans-cinnamaldehyde and mild heating on C. sakazakii populations in reconstituted infant formula

復原嬰幼兒牛乳樣品中阪崎克羅諾腸桿菌的起始濃度約為6.6（lg（CFU/mL））。由圖1A可知，對照組在120 min內細菌總數與起始值沒有顯著性差異（P＞0.05）。經0.1%反式肉桂醛處理120 min后，阪崎克羅諾腸桿菌總數下降約0.3（lg（CFU/mL））。經0.2%、0.3%和0.4%反式肉桂醛處理60 min后，細菌總數分別下降約1.1、2.7、4.7（lg（CFU/mL））。處理90 min后，0.4%反式肉桂醛使阪崎克羅諾腸桿菌細菌總數下降至檢出限以下。

由圖1B可知，對照組在120 min細菌總數增加約0.8（lg（CFU/mL）），這說明阪崎克羅諾腸桿菌對45 ℃有一定的耐受能力。經0.1%、0.2%和0.3%反式肉桂醛處理20 min后，阪崎克羅諾腸桿菌細菌總數下降約0.9、3.1、3.5（lg（CFU/mL）），經0.4%反式肉桂醛處理20 min及0.3%反式肉桂醛處理40 min后，細菌總數下降至檢出限以下。

由圖1C可知，對照組在作用60 min后，阪崎克羅諾腸桿菌總數下降約0.5（lg（CFU/mL）），但作用90 min與60 min沒有顯著性差異（P＞0.05）。經0.1%、0.2%和0.3%反式肉桂醛結合50 ℃處理20 min后，阪崎克羅諾腸桿菌總數分別下降約1.9、2.7、4.8（lg（CFU/mL））。經0.1%和0.2%反式肉桂醛結合50 ℃處理90 min后，細菌總數分別下降約3.4、6.2（lg（CFU/mL））。0.3%反式肉桂醛在作用40 min及0.4%的反式肉桂醛作用在作用10 min時將阪崎克羅諾腸桿菌的總數降低至檢出限以下。

由圖1D可知，反式肉桂醛和55 ℃溫和加熱結合與45 ℃和50 ℃相比對阪崎克羅諾腸桿菌有較強的抑殺效果。對照組在作用90 min后，阪崎克羅諾腸桿菌總數下降約3.0（lg（CFU/mL））。經0.1%反式肉桂醛處理40 min后，阪崎克羅諾腸桿菌總數下降約3.8（lg（CFU/mL）），處理60 min后，細菌總數降低至檢出限以下。經0.2%反式肉桂醛處理20 min后，阪崎克羅諾腸桿菌總數下降約3.8（lg（CFU/mL）），處理40 min后，細菌總數降低至檢出限以下。經0.3%反式肉桂醛處理10 min后，阪崎克羅諾腸桿菌總數下降約5.7（lg（CFU/mL）），處理20 min后，細菌總數降低至檢出限以下。經0.4%反式肉桂醛處理5 min后，阪崎克羅諾腸桿菌總數下降約4.6（lg（CFU/mL）），處理10 min后，細菌總數降低至檢出限以下。

2.2 對阪崎克羅諾腸桿菌細胞膜完整性的影響

圖2 不同處理組對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29544細胞膜熒光強度的影響Fig. 2 Fluorescence of C. sakazakii ATCC 29544 subjected to various treatments

實驗首先構建了綠色熒光與細胞膜完整細菌百分比的線性關系，得到綠色熒光強度與細胞膜完整細菌百分比的線性擬合方程：y＝431.3x+329.5（R2＝0.988）。由圖2可知，未經反式肉桂醛和溫和加熱處理的對照組，細胞膜完整的細菌百分比為100%，經0.2%反式肉桂醛處理20 min后，細胞膜完整的細胞比例為2.73%，與對照組有極顯著差異（P＜0.01）。經0.2%反式肉桂醛與50 ℃結合作用處理20 min，細胞膜完整的細胞比例僅為0.65%，與對照組有極顯著差異（P＜0.01）。

2.3 對阪崎克羅諾腸桿菌細胞形態的影響

圖3 場發射掃描電子顯微鏡下阪崎克羅諾腸桿菌的形態Fig. 3 Scanning electron micrographs of C. sakazakii

場發射掃描電子顯微鏡觀測發現，未經溫和加熱和反式肉桂醛處理的阪崎克羅諾腸桿菌呈棒狀，菌體飽滿，表面光滑（圖3A、E）。經0.2%反式肉桂醛作用后，阪崎克羅諾腸桿菌菌體從中部干癟，細胞扁平呈橢圓狀，且部分細胞破碎，出現碎片（圖3B、F）。經50 ℃處理的阪崎克羅諾腸桿菌菌體出現皺縮，并有部分細菌破裂（圖3C、G）。反式肉桂醛與溫和加熱結合作用后阪崎克羅諾腸桿菌的形態如圖3D、H所示，結合作用后1 h，部分細胞干癟，部分細胞破裂。結合作用后2 h，大部分菌體破裂且瓦解為碎片。結合作用比反式肉桂醛單獨作用和溫和加熱單獨作用造成的菌體皺縮干癟程度更大，破碎菌體比例更大。

3 討 論

研究表明，與腸桿菌科的其他屬種相比，阪崎克羅諾腸桿菌有著較強的耐干燥的能力[23]，能夠在干燥的乳粉中存活2 年[24]。Breeuwer等[25]發現阪崎克羅諾腸桿菌能夠通過維持細胞膜蛋白和磷脂的穩定從而保護自身應對高滲透壓環境。這說明阪崎克羅諾腸桿菌能夠在乳粉的貨架期中長期存活，為抑殺阪崎克羅諾腸桿菌從而降低其引起的感染，食用前的沖調乳粉過程尤為重要。盡管WHO已推薦消費者使用70 ℃的熱水沖調乳粉迅速降低至適宜的溫度，但由于該方法存在操作繁瑣，導致乳液感官品質及營養改變、易造成燙傷等多種缺點而不被消費者廣泛接受。溫和加熱結合天然物質對食品中食源性致病菌的抑殺作用成為近年來的研究熱點。Espina等[26]研究結果表明200 μL/L柑橘精油與54 ℃結合作用與單獨加熱相比能夠顯著縮短作用時間，提高蘋果汁中大腸桿菌O157:H7的抑殺效率。與美國食品藥品管理局推薦的71.11～82.22 ℃處理果汁的方法相比，能夠減少能耗并維持果汁良好的感官性狀。Gabriel等[27]研究結果表明，香草醛及甘草根提取物與55 ℃結合能夠有效降低椰汁中大腸桿菌O157:H7的數量。Choi等[28]研究結果表明20 mmol/L辛酸和30 mmol/L香草醛結合45 ℃能在5 min將復原嬰幼兒牛乳中的鼠傷寒沙門氏菌降低至檢出限以下（起始菌濃度約為7.0（lg（CFU/mL））。

在實驗中，0.3%反式肉桂醛處理的復原嬰幼兒牛乳在50 ℃和55 ℃能夠顯著降低阪崎克羅諾腸桿菌的數量，在作用20 min使阪崎克羅諾腸桿菌總數至檢出限以下，然而在相同的作用時間內，反式肉桂醛在50 ℃和45 ℃對阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺作用較弱（分別下降4.8、3.5（lg（CFU/mL）））。類似的，Jang等[11]研究表明與50 ℃和55 ℃相比，辛酸在45 ℃下對阪崎腸桿菌抑制作用較弱。Char等[29]發現當溫和加熱溫度升高時，香草醛在橙汁中的殺菌作用更強。反式肉桂醛隨溫度升高抑殺作用增強可能歸因于升高的溫度使反式肉桂醛在復原嬰幼兒牛乳中的溶解度升高。同時，猜測溫和加熱作用能夠造成細菌細胞膜受損從而增強反式肉桂醛的抑殺作用。

為闡明反式肉桂醛與溫和加熱結合對阪崎克羅諾腸桿菌細胞形態的改變及細胞膜的損傷，利用場發射掃描電子顯微鏡對未處理、經過反式肉桂醛處理、經過溫和加熱處理和經過反式肉桂醛與溫和加熱結合處理的阪崎克羅諾腸桿菌進行了觀測。結果表明單獨溫和加熱作用使細胞皺縮，延長作用時間，菌體出現了破碎，呈現作用時間依賴性。這是由于溫和加熱影響了細胞膜蛋白的空間結構松散、伸展，造成細胞膜的穿孔和裂隙，并且使膜蛋白更容易被蛋白酶水解。單獨反式肉桂醛作用使阪崎克羅諾腸桿菌菌體皺縮及破裂。Pasqua等[30]通過測定處理后的細菌細胞膜不飽和脂肪酸含量，得出肉桂醛的主要作用靶點在于細胞膜，肉桂醛能夠增大菌體細胞膜的面積，改變細胞膜的結構，并能夠使金黃色葡萄球菌細胞膜破裂，同時，肉桂醛也能夠穿透細胞膜進入細胞，造成菌體死亡。Helander等[31]研究推測反式肉桂醛是通過OM轉運孔蛋白進入細胞的。本研究中，溫和加熱和反式肉桂醛結合作用使菌體破裂數量增多，瓦解破碎程度增大，這說明結合作用對細胞膜的破壞程度大于反式肉桂醛和溫和加熱單獨作用。

本實驗探究了反式肉桂醛與溫和加熱結合對復原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺效果，結果表明這種結合作用對阪崎克羅諾腸桿菌有良好的抑殺效果。反式肉桂醛的抑殺活性隨溫度的升高而增大，0.4%反式肉桂醛與55 ℃結合在10 min內使阪崎克羅諾腸桿菌全部失活。通過LIVE/DEAD?細菌活性檢測試劑盒檢測結合作用對細胞膜完整性的影響，結果表明與對照組相比單獨反式肉桂醛作用與結合作用使細胞膜完整性極顯著降低（P＜0.01）。利用場發射掃描電子顯微鏡探究對細胞形態的影響，結果表明反式肉桂醛與溫和加熱結合增大了細胞形態的皺縮干癟程度，并且使細胞破裂比例增大。以上結果表明反式肉桂醛有潛力作為抑菌劑在嬰幼兒乳粉中應用，反式肉桂醛在乳粉復原沖調時與溫水或溫和加熱結合，能夠降低通過污染的嬰幼兒乳粉造成阪崎克羅諾腸桿菌感染的風險，這種結合的方法有潛力替代常規使用高溫度水沖調乳粉的方式。然而，現行的GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中，僅規定了肉桂醛作為防腐劑用途在表面處理的鮮水果的殘留量，對復原嬰幼兒牛乳中的限量問題沒有規定。因此，反式肉桂醛作為食品添加劑在復原嬰幼兒乳粉中的添加量及與溫和加熱結合對復原嬰兒牛乳的感官品質的影響，需要在推薦使用前深入探究。

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