一氧化氮對低溫貯藏桃果實線粒體氧化損傷的影響

胡珊，葉志恒，馮建榮，朱樹華

(1.石河子大學農學院園藝系/特色果樹栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832003；2.山東農業大學化學與材料科學學院， 山東泰安 271018)

0 引 言

【研究意義】桃(Prunuspersica)屬于溫敏性水果，低溫貯藏下易發生冷害[1]。冷害會使果實發生生理癥狀的改變，比如增加果實重量的損失以及膜完整性的喪失[2]。冷害會使果實產生明顯病變癥狀，比如果肉褐變、不能正常后熟以及腐爛加快等[2, 3]。線粒體是細胞中供應能量的主要場所。線粒體參與細胞分化、信息傳遞及細胞凋亡等過程，且具有調控細胞生長及細胞周期的能力[4]。線粒體數量和形態反映了細胞類型的能量需求。活性氧(reactive oxygen species, ROS)是線粒體大量呼吸產生的[5]。不同的ROS含量在細胞內有著不同的作用，線粒體內膜脂過氧化程度的增加是由于線粒體ROS含量高會產生過多的氧化脂質[6]。線粒體內存在很多抗氧化酶，可以分解線粒體內的ROS，維持線粒體內的氧化還原平衡，減輕線粒體內氧化損傷[7]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)轉性催化O2-，將其轉化成H2O和O2，是線粒體內抵抗ROS的第一道防線[8]。過氧化氫酶(catalase, CAT)將線粒體內的H2O2轉化為H2O 。過氧化物酶(peroxidase, POD)可以催化H2O2及過氧化脂類的分解[11, 12]。 線粒體抗氧化酶彼此間的協同作用可以清除線粒體內多余的ROS，維持線粒體內氧化還原的平衡[13]，而保證線粒體正常生理活動。一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種脂溶性氣體分子且具有生物活性。【前人研究進展】NO可以介導植物多種生理生化和免疫防御反應[14, 6]。NO在調節植物代謝和調控植物線粒體功能方面有著重要的作用。NO在線粒體中通過抑制細胞色素C的釋放量間接調節線粒體功能[17]。NO可以參與線粒體呼吸過程，調節線粒體內ROS的生成[18]。【本研究切入點】外源NO處理可以增強植物線粒體的抗氧化性[19,20]。研究桃果實在冷藏期間NO對線粒體膜及線粒體抗氧化系統。【擬解決的關鍵問題】以新泰紅桃為試材，用15 μmol/L NO、5 μmol/L c-PTIO (2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl- 3-oxide)浸泡處理桃果實，測定桃果實冷藏期間NO對其品質影響，NO對冷藏期間桃果實線粒體完整性、線粒體活性氧及抗氧化酶活性的影響，為NO在桃果實貯藏保鮮應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

桃品種為新泰紅 (Prunspersica[L.] Batsch, cv. Xintaihong), 2017年7月18日采摘于山東省泰安市新泰市桃基地。選取無病蟲害、無機械損傷以及果個均勻的七成熟果實，0℃下過夜預冷后，樣品分為三組，每組100枚桃果實，分別用15 μmol/L NO、5 μmol/L c-PTIO 和對照 (去離子水)浸泡30 min。將處理后的桃果實放置于0℃恒溫培養箱內，每一周取一次樣用于品質相關指標測定，桃果實切成小塊后冷凍于-80℃保存用于線粒體提取。

1.2 方 法

1.2.1 硬度測定

采用艾德堡GY-4果實硬度計測定，探頭直徑為11 mm，測試結果取下壓峰值，每個處理取9個果實，每個桃果實取3個測量點測試，單位為N/cm2。

1.2.2 可溶性固形物含量

1.2.3 色差

利用色差計測定桃果實表面部分的顏色。以標準白度(L=97.06，a=0.04,b=2.01)來校準測定所使用的色差計。測定系統顯示(L*，a*，b*)

1.2.4 失重

用電子天平測定各組桃果實的鮮重，貯藏期間每隔一周用電子天平稱取每組桃果實的重量。失重率計算公式如下：

1.2.5 線粒體提取及純化

參照Jing的方法提取桃果實線粒體[21]。利用蔗糖密度梯度離心法純化線粒體，并用3 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.5 100 mmol/L)重懸浮。

1.2.6 線粒體耗氧量

線粒體耗氧量的測定參照潘儼的方法[22]，線粒體耗氧量表示為nmol min/ mg/protein。

1.2.7 線粒體呼吸控制率(RCR)

參照倪海霞[23]的方法用Hansatech液相氧電極測量線粒體呼吸控制率。RCR即加入ADP時(Ⅲ態)的呼吸速率與ADP耗盡后(Ⅳ態)的呼吸速率比值。

1.2.8 線粒體膜電勢

參考Baracca[24]方法來測定線粒體膜電勢。線粒體的膜電勢表示為[(ΔF/Fi)s/ mg/protein]。

1.2.9 線粒體細胞色素C含量

線粒體細胞色素C含量測定參照Balaban等[25]方法，根據標準曲線計算每克線粒體蛋白對應細胞色素C含量(μmol)。

1.2.10 線粒體活性氧(ROS)含量

線粒體中ROS含量的測定參考Jambunathan[26]方法。桃果實中ROS的含量表示為a.u.mg/protein。

1.2.11 線粒體過氧化氫酶(CAT)活性

線粒體中CAT的活性測定參考 Zhong[27]方法，檢測液中由于CAT催化引起的240 nm下的吸光度每降低0.001個單位被定義為一個CAT酶活性(U)。線粒體中CAT的單位酶活性表示U mg/protein/sec。

1.2.12 線粒體過氧化物酶(POD)含量

桃果實線粒體內POD含量測定參考Rahnama[28]方法。POD的單位酶活性定義由POD的催化作用引起的580 nm下每秒內增加0.001個單位的吸光度定義為一個酶活性單位(U)。線粒體POD的活性表示為U mg/protein/sec。

1.2.13 線粒體超氧化物歧化酶(SOD)含量

桃果實線粒體SOD含量測定采用NBT光還原法[29]。線粒體SOD的活性以SOD抑制NBT的光還原率50%為酶活單位(U)。線粒體SOD的活性表示為 U mg/protein。

2 結果與分析

2.1 NO對冷藏桃果實品質影響

研究表明，桃果實在冷藏過程中硬度呈下降趨勢，0 d時桃果實硬度為53 N/cm2，第5周時分別為32.2 (對照)、30.1 (c-PTIO)、38.8 N/cm2(NO)。貯藏期間，NO處理桃果實硬度均高于對照和c-PTIO處理，第3周，NO處理桃果實硬度是對照的1.23倍，是c-PTIO處理的1.33倍(圖1A)。0 d桃果實色差L*值為76.4，在桃果實冷藏貯藏期間一直下降，且在第5周達到最低值，NO處理桃果實色差L*值是對照處理的1.07倍，是c-PTIO處理的1.13倍(圖1B)。桃果實冷藏貯藏期間可溶性固形物含量處于下降趨勢，失重率處于上升趨勢，0 d時桃果實的可溶性固形物含量為14.55，失重率為0(圖1CD)。NO處理，可溶性固形物含量均高于對照和c-PTIO處理，貯藏期間，NO處理桃果實失重率低于對照和c-PTIO處理。第4周，NO處理，SSC是對照的1.09倍，c-PTIO的1.14倍。圖1

注：每組數據平均值±SE(n = 3)

圖1 桃果實在低溫貯藏期間不同NO溶液下硬度(A)、色差L值(B)可溶性固形物含量(C)和失重率(D)變化
Fig.1 Effects of NO solution on firmness (A), color difference L*value (B) soluble solid content (C) and weight loss rate (D) during low temperature storage of peach fruit

2.2 NO對冷藏桃果實線粒體影響

研究表明，桃果實線粒體呼吸耗氧量在0 d時是41.0 nmol min/mg/protein，冷藏桃果實線粒體呼吸在第3周達到峰值，之后開始下降，且在貯藏期間c-PTIO和對照處理桃果實耗氧量均高于NO處理。第5周，NO處理桃果實線粒體耗氧量是對照處理的71.9%，是c-PTIO處理的40.0%(圖2A)。線粒體RCR在第0 d時為2.9，低溫冷藏過程中線粒體RCR在第2周出現峰值后逐漸下降，且在整個貯藏期間NO處理桃果實線粒體RCR均高于對照和c-PTIO處理，第2周，NO處理桃果實線粒體RCR是對照的1.30倍；第4周，NO處理桃果實線粒體RCR是c-PTIO處理的1.57倍(圖2B)，NO處理可以維持線粒體完整性，減少線粒體耗氧量，延長桃果實貯藏期。冷藏期間，線粒體膜電勢隨著貯藏時間的增加而降低，0 d時線粒體膜電勢為20.4 s/g/protein，貯藏期間，NO處理桃果實線粒體膜電勢始終高于對照和c-PTIO處理。第2周，NO處理是對照的1.68倍，c-PTIO的2.39倍，在冷藏期間，NO處理可以有效的維持線粒體內外離子和線粒體膜電勢平衡(圖2C)。桃果實在冷藏期間，線粒體細胞色素C含量隨著貯藏時間的增加而減少，0 d時，線粒體細胞色素C含量為24.8 μmol g/protein， NO處理低于對照和c-PTIO處理， 3周時，NO處理是對照的54.7%，是c-PTIO的50.1%(圖2D)。圖2

注：每組數據平均值±SE(n = 3)

圖2 桃果實在低溫貯藏期間不同NO濃度下線粒體耗氧量(A)、線粒體呼吸控制率(B)、線粒體膜電勢(C)以及線粒體細胞色素C含量(D)變化
Fig.2 Effects of NO on mitochondrial oxygen consumption (A), mitochondrial respiratory control rate (B), mitochondrial membrane potential (C) and mitochondrial cytochrome C content (D) during low temperature storage

2.3 NO對冷藏桃果實線粒體ROS含量的影響

研究表明，低溫貯藏過程中，線粒體ROS含量在第3周出現峰值后開始下降，c-PTIO處理明顯高于對照和NO處理。0 d時線粒體ROS含量為119.5 a.u mg/protein，第1周，NO處理是對照的50.4%，是c-PTIO處理的43.2%。清除NO后，線粒體完整性遭到破壞，線粒體ROS含量及膜脂過氧化損傷程度增加。圖3

注：每組數據平均值±SE(n = 3)

圖3 桃果實在低溫貯藏期間不同NO濃度下線粒體活性氧含量變化
Fig.3 Effects of NO on mitochondrial reactive oxygen species in peach fruit during low temperature storage

2.4 NO對冷藏桃果實線粒體抗氧化酶活性的影響

研究表明，低溫貯藏過程中，NO處理線粒體CAT活性均高于對照和c-PTIO處理，0 d時線粒體CAT活性為16.6 U min/mg/protein， 第2周，NO處理是對照的1.59倍，是c-PTIO的3.42倍(圖4A)。貯藏期間，線粒體POD呈下降趨勢，NO處理線粒體POD活性最高。0 d時，線粒體POD活性為128.2 U min/mg/protein，第3周，NO處理是對照的1.41倍。第4周，NO處理POD活性是c-PTIO處理的1.91倍(圖4B)。桃果實SOD活性受多種因素影響。NO處理桃果實線粒體SOD活性在整個貯藏期間活性最高，第1周，NO處理是對照的1.78倍。第4周，NO處理是c-PTIO處理的1.81倍，NO處理桃果實線粒體抗氧化酶活性均高于對照和c-PTIO處理。圖4

注：每組數據平均值±SE(n = 3)

圖4 桃果實在低溫貯藏期間不同NO濃度下線粒體抗氧化酶活性、過氧化氫酶(A)、過氧化物酶(B)、超氧化物歧化酶(C)變化
Fig.4 Effects of NO on mitochondrial antioxidant enzyme activity during peach storage during low temperature storage. CAT (A), POD (B), SOD (C)

3 討 論

硬度、SSC、水分含量及褐變是衡量果實商品價值的重要指標。常溫下，采后果蔬隨著貯藏時間的增加會出現硬度下降，失水、可溶性固形物含量及色差L*值下降等生理癥狀[30]。通過低溫冷藏可以減弱果蔬的呼吸強度從而達到保鮮的效果[31]。桃果實在冷藏過程中，硬度有短暫的增大趨勢，可能是桃果實在貯藏過程中隨著呼吸作用，酶活變化以及果膠變化等原因，大量失水，出現果皮皺縮的現象[32]。NO處理可以顯著維持桃果實的硬度，這與NO在桃果實貯藏期間抑制了纖維素和半纖維素的分解，減少果膠酸和可溶性果膠的含量有關[33,34]。

余克威等[35]發現NO不僅可以促進線粒體內物質的合成而且在調節線粒體介導細胞凋亡上有著重要的作用。研究發現，低溫貯藏過程中，經NO處理的桃果實可以保持線粒體的完整性，維持線粒體內環境穩定，這與呂小華[36]的研究相似。ROS被認為是有害的分子，越來越受到廣泛關注，線粒體是細胞內ROS的主要來源場所[37]。在正常的情況下，生物體內的ROS是處于一種平衡的狀態，可以增強生物免疫功能，但是，采摘后，離開母體的營養供應，桃果實的生理功能遭到破壞，ROS大量增加，破壞線粒體膜的完整性，釋放細胞色素C，從而引發線粒體膜電位變化，導致細胞凋亡[38]。已有研究表明，線粒體內抗氧化酶可以有效地清除線粒體內ROS含[39,40]量(研究發現在低溫冷藏過程，NO處理可以維持桃果實內線粒體抗氧化酶活性，減少ROS的積累，在維持膜電勢的同時降低了細胞色素C含量，達到保鮮的效果)。在冷藏過程中，NO處理可以減緩線粒體的氧化損傷程度。

低溫冷藏期間，15 μmol/L NO處理可以維持桃果實品質，保持線粒體完整性，延緩線粒體ROS含量增加，并提高線粒體抗氧化酶活性，從而維持線粒體抗氧化系統的穩定，減弱線粒體的氧化損傷。

4 結 論

4.1 冷藏貯藏期間NO可以維持桃果實硬度，延緩色差L*值的下降，提高SSC并降低桃果實的失重率。NO處理可以維持桃果實的品質，起到貯藏保鮮的效果。NO可以維持線粒體膜完整性，降低細胞色素C的含量，從而維持細胞的活性。NO處理桃果實線粒體抗氧化酶有效的清除了線粒體內過多的ROS，維持了線粒體內的動態平衡。

4.2 在第5周時，桃果實品質指標分別為0 d的73.2%(硬度)，87.2%(色差L值)，1.02倍(SSC)，NO處理延長桃果實貯藏時間；NO可以維持桃果實低溫貯藏過程線粒體膜電勢，在第5周時為0 d的50%，NO處理維持線粒體完整性及線粒體生理功能。NO通過維持線粒體內抗氧化酶活性降低線粒體內ROS含量，第5周時NO處理桃果實ROS含量為對照處理的89.8%，c-PTIO處理的82.9%，在桃果實低溫冷藏過程中，NO處理通過降低線粒體中ROS含量來提高線粒體抗氧化系統的穩定性。