基于1H-NMR技術(shù)尋找非酒精性脂肪肝肝郁脾虛證的差異代謝標志物?

李若瑜，苗宇船△，蘇趙威，賈 飛，李明磊，劉 楊，郭繼龍，關(guān) 偉，張冉冉，何麗清

(1. 山西中醫(yī)學院，山西 晉中 030619； 2. 建德市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 建德 311612)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病。本研究采用核磁共振技術(shù)(1H-NMR)分析NAFLD肝郁脾虛證模型大鼠血清中內(nèi)源性代謝物濃度的變化，以期篩選出與NAFLD肝郁脾虛證相關(guān)的代謝標志物，為揭示NAFLD的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量200～220 g，北京海淀興旺實驗動物養(yǎng)殖場提供(實驗動物合格證號SCKK(京)2014-0013)，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 主要儀器與試劑

5-羥色胺(5-HT)試劑盒、去甲腎上腺素(NE)試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；D-木糖排泄率測定試劑盒購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；600 MHz AVANCE III NMR波譜儀，德國Bruker公司；美國Image-Pro Plus v5.1圖像分析管理系統(tǒng)；D2O，購自美國merck試劑公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 NAFLD肝郁脾虛證動物模型的建立 將實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組各8只，對照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲水；模型組給予高糖高脂飼料+饑飽失常法+慢性束縛應(yīng)激刺激+夾尾法，建立NAFLD肝郁脾虛證動物模型[1-2]。12周末麻醉采血，常規(guī)制備血清，標本儲存于-80 ℃冰箱中備用。取肝左葉石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織學變化。

1.3.2 樣本預(yù)處理 取解凍后血清450 μL，加入D2O350 μL渦旋30 s，于4 ℃ 13000 r/min離心20 min，取上清液600 μL，置于內(nèi)徑5 mm的NMR樣品管中備用。

1.3.3 1H-NMR圖譜處理 采用 Mest Re Nova 核磁圖譜專業(yè)處理軟件對所有1H-NMR圖譜進行傅立葉轉(zhuǎn)換并進行相位、基線調(diào)整,以TSP 的化學位移δ 3.04為標準進行化學位移校正。以δ 0.01為單位，對δ 0.01～8.50區(qū)域的譜圖進行等寬度分割,去除δ 4.67～4.90區(qū)域水峰；對圖譜進行分段積分,將積分數(shù)據(jù)歸一化處理,使數(shù)據(jù)集中在 0～1 內(nèi)用于多元統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果與分析

2.1 NAFLD肝郁脾虛證模型復(fù)制驗證結(jié)果

2.1.1 一般行為學特點 模型組大鼠表現(xiàn)為明顯厭食，體質(zhì)量減輕，行動遲緩，弓背靜臥，背毛散亂無光澤，糞便溏軟。

2.1.2 NAFLD病理組織學結(jié)果 圖1、2顯示，對照組大鼠可見正常肝組織形態(tài)；模型組大鼠肝細胞胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的脂肪空泡,將細胞核擠壓至一側(cè)(黑色箭頭所示),肝小葉、門管區(qū)炎細胞浸潤，表明大鼠非酒精性脂肪肝模型復(fù)制成功。

表1 各組大鼠GLU、FFA、5-HT、NE、D-木糖排泄率變化比較

注： 與對照組比較：*P<0.05

圖1 對照組大鼠肝組織病理切片(HE染色 ×400)

圖2 模型組大鼠肝組織病理切片(HE染色 ×400)

2.1.3 肝郁脾虛證指標檢測結(jié)果 表1顯示，與對照組比較模型組血糖、血脂升高，5-HT、NE和D-木糖排泄率顯著降低(P<0.05)，成功建立大鼠肝郁脾虛證模型。

圖3 大鼠血清1H-NMR圖譜注：1.丙酮[2.24(s)]；2.精氨酸[1.72(m)3,25(t)]；3.丙氨酸[1.48(d)3.77(q)]；4.甜菜堿[3.28(s)]；5.肌酐[3.04(s)3.94(s)]；6.α-D-葡萄糖[5.24(d)3.23(t)]；7.β-D-葡萄糖[4.65(d)]；8.二甲基甘氨酸[2.92(s)3.70(s)]；9.3-羥基丁酸[1.20(d)]；10.甘油[3.54(dd)3.66(dd)]；11.糖原[5.39(s)]；12.異亮氨酸[0.99(d)3.65(d)]；13.α-酮戊二酸[2.44(t)]；14.乳酸[1.33(d)、4.12(q)]；15.亮氨酸[0.96(t)]；16.賴氨酸[1.72(m)1.90(m)]；17.肌醇[3.53(d)]；18.N-乙酰糖蛋白[2.05(s)]；19.O-乙酰糖蛋白[2.14(s)]；20.琥珀酸[2.37(s)]；21.蘇氨酸[1.33(d)3.58(d)4.24(q)]；22.酪氨酸[6.89(d)]；23.纈氨酸[1.01(d)3.61(d)]

2.2 代謝組學結(jié)果

2.2.1 圖3顯示，1H-NMR圖譜的指認與分析 通過大鼠血清1H-NMR圖譜，結(jié)合HMDB數(shù)據(jù)庫指認出23種代謝產(chǎn)物，各物質(zhì)對應(yīng)化學位移與峰型。

2.2.2 多元統(tǒng)計分析 圖4、5顯示，運用SIMCA-P+ 進行PLS-DA分析得出積分圖和S-plot圖。圖4顯示，模型組與對照組明顯沿t[1]軸分開，提示組間差異明顯，模型R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875，即其中43.6%的變量作為主要成分構(gòu)造模型，模型的解釋率99.9%，模型的預(yù)測率87.5%。圖5中“S”曲線上的點離原點越遠，其VIP值越大，代謝產(chǎn)物差異越明顯。由圖中可以找到VIP>1差異顯著的代謝產(chǎn)物。

2.2.3 尋找差異代謝產(chǎn)物 表2顯示，運用SPSS17.0軟件對所有代謝物的相對峰面積進行獨立樣本t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)者結(jié)合S-Plot圖的VIP值進行多元統(tǒng)計，得出9種可能是中醫(yī)證候潛在生物標志物的差異代謝物，并對其相對峰面積的變化進行計算。

圖4 大鼠血清1H-NMR下PLS-DA積分圖注：PC=3，R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875

圖5 大鼠血清1H-NMR下S-plot圖注：PC=3，R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875

代謝物化學位移(ppm)變化趨勢峰面積對照組模型組丙酮2.24+1.98×10-1±6.50×10-24.12×10-1±1.15×10-1**丙氨酸1.48-7.00×10-1±8.80×10-24.51×10-1±1.22×10-1**甜菜堿3.28+5.30×10-1±1.50×10-11.01×10-0±4.00×10-1*α-D-葡萄糖5.24+6.63×10-1±1.58×10-19.13×10-1±1.07×10-1**甘油3.66+2.12×10-1±2.20×10-23.25×10-1±7.10×10-2**異亮氨酸3.65+1.86×10-1±1.90×10-22.54×10-1±3.70×10-2**α-酮戊二酸2.44+2.15×10-1±4.10×10-23.33×10-1±8.60×10-2**蘇氨酸3.58+1.02×10-1±2.00×10-21.41×10-1±2.10×10-2**賴氨酸1.72+1.41×10-1±3.80×10-21.83×10-1±4.30×10-2*

注： 與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01

3 討論

NAFLD是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，其基本病理過程是以脂質(zhì)攝取過多和胰島素抵抗為首要環(huán)節(jié)引起脂肪在肝臟細胞儲積，涉及能量代謝紊亂和脂質(zhì)過氧化、免疫應(yīng)答紊亂等復(fù)雜過程。中醫(yī)認為，肝與脾在生理病理上聯(lián)系密切，肝主疏泄，脾主升清、運化，疏泄與運化相互為用。肝郁脾虛證的主要病機即肝失疏泄、脾失健運，正對應(yīng)NAFLD過程中的物質(zhì)能量代謝紊亂。NAFLD導致肝細胞受損后，肝臟代謝組分的變化可通過檢測血液獲得[3]，因此對NAFLD肝郁脾虛證的血清代謝組學研究具有重要意義。

模型組血清中甘油與FFA水平升高，可能提示機體內(nèi)脂肪酸水平升高，而過量的脂肪酸在氧化過程中產(chǎn)生大量ROS，導致肝細胞脂肪變性和壞死。甜菜堿可分解為三甲胺，是脂質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，其在甘氨酸合成時提供甲基，減輕脂質(zhì)過氧化作用，增加脂類代謝。模型組中甜菜堿的增多提示脂質(zhì)代謝增多。

胰島素抵抗貫穿NAFLD整個過程，最直觀的判定特征就是葡萄糖的攝取利用，模型組大鼠血糖明顯升高，提示組織對葡萄糖的利用率降低。丙酮是脂肪酸分解時產(chǎn)生的酮類化合物，其含量升高提示能量代謝的過程從葡萄糖利用轉(zhuǎn)為脂肪酸氧化。血清α中-酮戊二酸增加，表明三羧酸循環(huán)封閉[4]。

肝臟作為氨基酸代謝的中心，任何肝損傷都可能干擾氨基酸的代謝[5]。肝細胞膜損傷使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受到抑制，對氨基酸清除率降低，對胰高血糖素的滅活降低，導致內(nèi)源性蛋白處于高分解狀態(tài)，釋放出大量的氨基酸，使血中氨基酸水平增高[6]。模型組大鼠異亮氨酸水平升高，提示機體啟動了支鏈氨基酸的糖異生作用，以補充機體所需的能量[7]。蘇氨酸可與寡糖鏈結(jié)合，對保護肝細胞膜起重要作用，亦能促進磷脂合成和脂肪酸氧化，其水平升高可能是機體對NAFLD產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果，丙氨酸水平下降則與糖尿病等胰島素抵抗引起的疾病有關(guān)。

有研究表明[8]，糖類、脂類、蛋白質(zhì)的代謝紊亂可能是中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實驗測定了血清中9種與NAFLD相關(guān)的內(nèi)源性代謝物含量的變化并進行綜合分析，從脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗及氨基酸代謝紊亂等不同方面反映出NAFLD肝郁脾虛證的部分發(fā)病機制，有利于確定NAFLD肝郁脾虛證特征性的代謝變化，為證候客觀化研究提供了新的方法與思路。

參考文獻：

[1] 賈飛,苗宇船,蘇趙威,等.逍遙丸對肝郁脾虛證非酒精性脂肪肝病大鼠TLR4表達的影響[J].山西中醫(yī),2016,32(3):48-50.

[2] 蘇趙威,苗宇船,何麗清,等.當歸芍藥散加味治療非酒精性脂肪肝代謝組學研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2016,11(2):177-180.

[3] SHI X, WAHLANG B,WEI XL,et al.Metabolomic analysis of the effects of polychlorinated biphenyls in nonalcoholic fatty liver disease[J].J Proteome Res, 2012,11(7):3805-3815.

[4] WEI DD,WANG JS,WANG PR,et al.Toxic effects of chronic low-dose exposure of thioacetamide on rats based on NMR metabolic profiling[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2014,98:334-338.

[5] 張艷花,王東琴,李小偉,等.基于1H-NMR代謝組學技術(shù)尋找 CCl4致大鼠急性肝損傷的代謝標志物[J].藥物評價研究,2014,37(1):11-16.

[6] 張寧,楊祎楠,劉海洋,等.逍遙散干預(yù)肝損傷小鼠的代謝組學研究[J].中成藥，2014，36(1):171-175.

[7] 韓曉靜,范瑪麗,秦雪梅,等.基于代謝組學技術(shù)研究黃芩對小鼠代謝的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2016，22(15):85-91.

[8] 楊宇峰,齊艷文,徐娜,等.脾氣虛證代謝綜合征大鼠血液代謝組學研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2014,20(8):1056-1058.