譜效關系分析在中藥組方研究中的應用進展?

馮 鑫，房德敏，周永梅

(天津市天津醫院藥學部，天津 300211)

中藥復方制劑因藥味多、成分復雜、研發困難制約了其現代化和國際化的發展進程。近年來，中藥譜效關系研究快速發展，它將中藥指紋圖譜和藥效學通過化學計量學模型進行關聯，建立了以化學分析與生物活性評價相結合的綜合評價體系，為揭示中藥方劑中的藥效物質基礎和配伍規律提供了有效手段。但譜效研究所選擇的實驗設計方法和數據分析方法，是影響其結果準確性和可靠性的重要因素，故從方法設計、數據分析和研究缺陷等方面闡述譜效關系在中藥組方中的研究現狀及應用進展作一綜述。

1 方法設計

1.1 樣本選擇

樣本選擇是決定研究結果準確性的基礎，選擇具有代表性和說服力的研究樣本至關重要，一般常采用以下幾種方法篩選實驗樣本。

1.1.1 拆方分析 也稱撤藥分析，是將組方藥味通過排列組合拆分成不同組并進行組間差異研究。拆方研究的樣本確定方式不盡相同，可依據中醫組方原理，按照“君臣佐使”的順序逆向撤除使、佐、臣藥直至僅留君藥[1]，也可將方中各味排列組合，從單味、兩味、三味直至全方組合[2]；若是處方藥味稍多，可以采用單味方、缺單味方和全味方來確定研究樣本[3]，還有的是按研究側重點來確定藥味組合[4]。拆方研究只考慮方中藥味加減對藥效的影響，而未考慮藥量變化和提取工藝對藥效的影響。

1.1.2 統計篩選法 將統計設計引入樣本篩選，既可顧及藥味加減對藥效的影響，還可兼顧藥量及提取工藝等因素的影響。良好的統計設計能夠恰當選擇樣本量、嚴格控制誤差，充分顯示實驗效應，用低人力、物力和時間成本獲取滿意的結果。

(1)多因素設計采樣法：研究樣本受2個及以上因素影響時，需使用多因素設計采樣法。正交設計是研究多因素多水平的一種常用設計方法，是從全面實驗中挑選出有代表性且具有“均勻分散，齊整可比”特點的點進行實驗，可大大減少工作量，是一種高效、快速、經濟的實驗設計方法。平胃散揮發油促胃排空作用的藥效物質研究中，利用此法篩選不同組方、藥量、揮發油配比的研究樣本，探索促胃排空的主要起效組分[5]。劉廷等[6]也用此法篩選雙黃連口服液對抗甲型H1N1流感病毒對MDCK細胞損傷的組方樣本。

(2)拉丁超立方采樣法：該方法是抽樣技術的新發展，以分層采樣模式，用采樣值反映隨機變量的整體分布，保證所有采樣區均能被采樣點覆蓋。它可確保偏遠事件也被有效涵蓋，使研究樣本更具有代表性和說服力，提高抽樣效率。在氣滯胃痛顆粒治療胃潰瘍和六味五靈片抗肝纖維化的譜效關系研究中，均是利用拉丁超立方采樣方法將組方中的藥味隨機抽樣成不同藥量配比的組方樣本進行研究[7-8]。

1.1.3 篩選有效部位群 中藥方劑的物質基礎具有整體性、綜合性和模糊性。有效部位群是中藥復方中化學類型明確、主成分清楚、含量達到規定標準的物質群，是中藥方劑精制的基礎。在對中藥組方或配伍藥對進行譜效關系分析時，篩選有效部位群作為研究樣本更具合理性。

篩選有效部位群應采用遞進式的研究模式。對有效部位群缺乏前期研究時，可先根據各藥味所含組分的物理化學特性進行篩選。如利用系統溶劑法篩選二神丸在不同提取溶劑中的提取部位，初步確認二神丸產生溫脾止瀉作用的是極性較小的化學組分[9]。在研究有一定前期積累時，則可針對之前的篩選結果進行深入研究。如在確認加味四妙丸組方中的揮發油、生物堿、皂苷、有機酸、糖類組合物是其有效部位群后，再將各有效部位提取物以不同方式組合，探討其共有峰的成分特征與藥效的相關性[10]；同樣，氣滯胃痛顆粒也是先確認枳殼黃酮、檸檬烯、香附黃酮及香附揮發油是該藥的有效部位群，然后將這4種有效組分通過正交設計組合成不同的配方，研究各有效部位的藥效強弱及之間的交互作用，為該藥的質控及機制研究提供理論依據[11]。

1.1.4 載藥血清 1988年日本首先提出中藥“血清藥理學”的新概念，因為中藥成分復雜，只有最終入血的成分才是中藥的藥效物質基礎，血中可能包含藥物原型、代謝物、組分間反應形成的新成分，也可能是機體被刺激后產生的內源物質。這些組分以血液為媒介輸送到靶點發揮藥理作用，即載藥血清才是真正起效“制劑”[12]。選擇載藥血清做樣本需采集動物用藥后血液分離血清，用以替代藥物樣本進行后續研究。在氣滯胃痛顆粒復方藥材的抗炎活性、復方五仁醇膠囊保肝作用以及芍藥-甘草復方效應組分的譜效關系研究中，均是用載藥血清作為研究樣本[13-15]。

1.2 藥效學實驗方法選擇

藥效學實驗方法的選擇也尤為關鍵，中藥藥效學研究應遵循中醫藥理論，選與中醫“證”或“病”相符或相近的動物模型或實驗方法。若觀測藥物直觀療效，常選用動物模型或離體器官；若研究作用機制則一般選用細胞培養和生化實驗。評價標準應選特異性強、敏感性高、重現性好的指標。

1.2.1 在體實驗及動物模型選擇 中藥因藥效物質基礎復雜，“同癥不同病，同病不同癥”的現象屢見不鮮。藥效數據的可靠性及準確性直接關系到研究結果的可信度，故研究者應根據藥物的已知功效特點、作用機制及研究條件選擇最適宜的方法和指標。

氣滯胃痛顆粒促胃腸動力研究中，選擇小鼠胃腸動力學實驗，采用半固體碳末糊推進法和全胃腸道推進運動2種方法，以胃內容物殘留率、碳末在胃腸道全長中的占比，及首次碳末便的排便時間為觀測指標；同時將與胃腸動力密切相關的NO、cGMP和Ca2+含量等生化指標作為另一組評價指標，以在體實驗與生化檢測相結合的方法評定藥效[11]。同樣是胃排空試驗，平胃散揮發油的促胃排空作用則選擇大鼠灌服含藥牛奶和锝，用SPECT觀測不同時段大鼠胃內锝殘留量，通過線性擬合所得的全胃半數胃排空時間為藥效評價指標，進行譜效關系研究[5]。

心肌缺血治療藥劑的譜效關系研究所采用的實驗方法及觀測指標也不盡相同。當歸-川芎配伍紅花提取物的研究中，采用結扎大鼠冠狀動脈誘發急性心肌缺血的模型，以心肌梗死率及血清LDH水平的下降為觀察指標[16]。栝樓薤白滴丸是用小鼠灌藥第7天肌注異丙腎上腺素10 mg·kg-1的方式造模，以血漿CK含量作為藥效指標[17]。

在痛經治療藥物的研究中，陳永剛等[1]選擇急性血瘀證大鼠模型，以血漿黏度、全血黏度、紅細胞聚集指數、紅細胞壓積、血沉方程K值及紅細胞電泳指數等作為觀測指標，闡釋生化湯溫經止痛的藥效物質基礎及配伍原理。桃紅四物湯則選用已烯雌酚增敏后的小鼠，使用催產素來建立痛經模型，以扭體次數為觀測指標[18]。吳茱萸-當歸藥對的研究中，選用的是縮宮素所致大鼠子宮平滑肌條收縮試驗[19]。

1.2.2 體外藥效實驗選擇 當在體實驗及動物模型選擇困難，或難以得到滿意的藥效學量化數據時，可考慮選擇體外藥效實驗，如：實驗室檢測法、細胞病變效應法等。療效評價指標的選擇，必須采用已被證實且公認，與藥效作用機制密切相關的指標。

(1)實驗室檢測法：藏方甲嘎松湯揮發油體外抗氧化活性研究中，選擇DPPH和ABTS兩個自由基清除實驗，通過測定不同批次揮發油與工作液反應后的吸光度變化，考察其揮發油對兩種自由基的綜合清除能力[20]。在參芪通脈益智方提取工藝評價中，也是選擇DPPH體外抗氧化實驗作為老年癡呆性疾病的療效評價方法[21]。

(2)細胞病變效應法：氣滯胃痛顆粒治療胃潰瘍的研究中，以8%無水乙醇制造人胃黏膜上皮細胞損傷模型，以細胞增殖率、SOD增殖率和MDA抑制率作為體外藥效學指標[7]。在對該藥復方藥材抗炎活性的研究中，通過測定不同配比組方對LPS誘導小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7所釋放炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和NO)的抑制率[13]，以對比不同組方的抗炎效果。

雙黃連對抗H1N1流感病毒的研究中，以感染H1N1病毒后MDCK細胞的存活率為評價指標，評價不同配方的抗病毒作用[6]。六味五靈片抗肝纖維化研究是將與肝纖維化密切相關的LX-2肝星狀細胞的增殖抑制率作為療效指標，評價不同提取物的抗肝纖維化效果[8]。

2 數據分析方法

2.1 相關性分析

相關性分析是對兩個或多個具備相關性的變量元素進行分析，衡量變量因素間的相關程度[22]。中藥譜效研究主要是分析中藥指紋圖譜與療效兩變量間的關系，故常使用雙變量相關性分析(BCA)。因研究多以連續變量為主，故一般比較的是皮爾遜相關系數。

芍藥-甘草解痙活性成分研究，采用BCA法確定與解痙作用相關的藥效組分峰[14]。白虎湯的抗炎譜效研究同樣用該法證明了知母是白虎湯抗炎作用中最重要的藥材[1]。在烏頭湯抗炎藥效物質基礎與療效關系研究中，利用BCA證實烏頭湯優選方配伍的規律性和組方的合理性[4]。

2.2 灰色關聯分析(GRA)

灰色系統理論是20世紀80年代由鄧聚龍提出并創立的一門新興學科，它以部分信息已知、部分信息未知的小樣本、貧信息、不確定性系統為研究對象，通過對已知信息的生成、開發來提取有價值的信息，實現對系統運行及演化規律的正確描述和有效監控。一般中藥的組分缺失信息多，很適合運用灰色系統理論來研究。

GRA是根據灰色系統中各因素間發展趨勢的相似或相異程度來衡量因素間關聯程度的一種方法。若系統中兩個因素同步化程度高，說明二者關聯度較高，反之則較低。近年在對中藥復方有效成分、有效提取部位及提取工藝等研究中，GRA的應用日益增多。在二神丸溫脾止瀉、參芪通脈益智方的體外抗氧化活性、補中益氣丸的補血作用、黃芪-葛根藥對保護胃黏膜損傷等多項研究中，均運用GRA法分別得出各組方成分對藥效貢獻的大小順序[9,21-24]。

GRA不但可以確定中藥各組分與藥效貢獻的大小，還可以根據關聯度確定有效物質群及多成分間的相互作用。這在栝樓薤白滴丸抗心肌缺血研究、縮泉丸縮尿作用研究以及神香草體外抗炎活性等研究中均有所體現[17,25-26]。以GRA解析逍遙方3 種不同制備工藝與疏肝解郁療效間的關系，在證實該方為組分間協同起效的同時，還確認了新制劑工藝的合理性[27]。

2.3 正交投影偏最小二乘法(OPLS)

偏最小二乘回歸分析(PLS)是1983年由伍德等提出的，它是一種多因變量對多自變量的新型多元統計數據分析方法，集合了多元線性回歸分析(MLR)、典型相關分析(BCA)和主成分分析(PCA)等方法的特點，實現了多種數據分析方法的綜合應用，具有計算量小、預測精度高、無需剔除樣本、易于定性解釋等優點[28]。

OPLS是改良后的偏最小二乘法，能夠有效去除預測矩陣中與因變量無關的信息，改善模型的真實性及解釋性，較適用于摸索中藥復方中復雜的活性成分群，以解釋中藥復方制劑多成分協同的作用。在研究當歸四逆湯凝血作用時，通過OPLS分析，根據各藥材變異權重參數值總和的大小，確定了對延長凝血酶時間貢獻較大的色譜峰，經歸屬確認后，確定對延長凝血酶時間貢獻較大的藥材依次為當歸、桂枝、甘草、白芍[3]。

2.4 綜合分析法

表1顯示，中藥譜效關系研究中，使用單一統計分析方法往往不能反映真實的譜效關系結果，因此多數研究會采用多種統計方法相佐證的綜合分析方法。

2.4.1 BCA+ 多元回歸分析(MLR) BCA是研究變量間的密切程度，關系越密切相關系數越大。MLR是研究多個自變量與一個因變量之間是否存在某種線性或非線性關系的統計方法，可定量描述自變量對因變量的貢獻率，回歸系數越大影響越大。在中藥譜效關系分析中，BCA+MLR是采用較多的綜合分析方法。

強迫引入法(Enter)和逐步回歸法(Stepwise)是MLA常用的2種方法。Enter是將所有自變量一次性引入并進行分析，同時考察各因素的作用。Stepwise是按各因素的貢獻由大到小依次引入自變量，每引入一個自變量就對其進行顯著性分析，直至將所有具有顯著影響的因素全部引入。瀉白散祛痰、抗炎作用和梔子厚樸湯抗抑郁作用的研究使用的是BCA+ Enter分析法[29-30]，而桃紅四物湯治療痛經的研究則選用BCA+ Stepwise的方法[18]。

Enter 與 Stepwise 也各有缺陷。由于Enter分析同時引入的自變量較多，可能會使各因素的影響變小，掩蓋主要作用因素，使其不能通過顯著性檢驗；而Stepwise可對各變量進行顯著性檢驗，但不能同時分析各因素的作用，兩種方法具有互補性，因此有些研究也會同時采用Enter 和Stepwise 進行多元回歸分析。如加味四妙丸有效部位群和柴胡-黃芩藥對保肝作用有效部位的研究均采用BCA+ Enter/Stepwise的分析方法[10,31-32]。

2.4.2 BCA+GRA BCA明確反映兩變量間的相關程度與方向，GRA是通過研究已知信息來揭示未知信息，兩種分析方法互補，既可相互驗證又可以發現研究的缺陷與不足，揭示出新的研究突破點。利用該方法已確證藏方甲嘎松湯揮發油體外抗氧化作用的排序[20]，也指出復方大承氣湯的主要藥效組分，并非以往研究所認定的指標性成分，為該藥的藥效物質基礎研究提出了新的思路和突破口[33]。

2.4.3 主成分分析(PCA)+ BCA PCA是一種降維統計方法，利用數學變換將許多相關性很高的變量轉化成彼此相互獨立或不相關的變量，選出比原始變量個數少，但能解釋大部分變量的幾個新變量，即所謂主成分，以解釋資料的綜合性指標。BCA與PCA的分析思路均是篩選出少量具有代表性的指標，其不同在于BCA篩除的是信息冗余指標，使評價體系簡潔明快，PCA篩除的是對評價結果影響較小的指標，保留重要指標。六味五靈片抗肝纖維化作用的譜效研究就選擇了該方法[8]。

2.4.4 GRA+ BP神經網絡 BP神經網絡是按誤差逆向傳播算法訓練的多層前饋神經網絡，也是目前應用最廣的神經網絡。網絡具有輸入層、隱藏層和輸出層，其基本思想是梯度下降，利用梯度搜索技術使網絡的實際輸出值和期望輸出值的誤差均方差為最小。經過訓練的神經網絡能對類似樣本的輸入信息自行處理，輸出誤差最小的經非線形轉換的信息。BP神經網絡突出優點是具有很強的非線性映射能力和柔性的網絡結構。網絡的中間層數、各層神經元個數可根據具體情況任意設定，并隨結構的差異使其性能也有所不同。氣滯胃痛顆粒的譜效研究多采用GRA+ BP神經網絡的方法[7,11,13]。

2.4.5 GRA+ BCA+ MLR 在GRA與BCA相互驗證，中藥復方譜-效相關程度的基礎之上，可再配合MLR進一步確認組分對藥效的貢獻大小。逍遙散乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物抗抑郁譜效關系的研究即選用了該方法[34]。

表1中藥組方譜效關系研究中使用的綜合分析方法

Table 1 Comprehensive analysis method used in the study of spectrum effect relationshipof Chinese herbal prescription

綜合分析方法組方藥效研究結果參考文獻BCA+MLRBCA+Enter瀉白散祛痰、抗炎桑白皮為方中君藥,有2種成分與藥效正相關[29]梔子厚樸湯抗抑郁主要活性成分為和厚樸酚與厚樸酚,多組分協同起效[30]BCA+Stepwise桃紅四物湯治療痛經石油醚部位為主要有效提取部位,主要起效成分為亞油酸,十八碳烯酸、花生酸和二十七烷協同起效[18]BCA+Enter/Stepwise加味四妙丸抗痛風揮發油部位的大部分成分是主要藥效部位[10,31]柴胡-黃芩藥對保肝黃芩某一原形組分和一種體內代謝產物有明顯藥效[32]BCA+GRA藏方甲嘎松湯體外抗氧化揮發油組分整體協同起效,并確定了起效成分的排序[20]大承氣湯除身熱蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚等為方中的藥效物質基礎,可作為質控及工藝優化評價指標;除橙皮苷、蘆薈大黃素和厚樸酚外,大部分關聯度大的色譜峰尚無歸屬[33]PCA+BCA六味五靈片抗肝纖維化多成分間協同起效[8]GRA+BP神經網絡氣滯胃痛顆粒促胃腸動力建立預測模型,誤差絕對值<6.83%[7]抗潰瘍建立預測模型,誤差絕對值<8.16%[11]抗炎建立預測模型,誤差絕對值<7%[13]GRA+BCA+MLR逍遙散抗抑郁柴胡為君藥,柴胡皂苷為主要藥效成分,柴胡皂苷D、E、G與該藥醇提物的乙酸乙酯萃取物抗抑郁藥效關系最大[34]PCA+Hierarchical聚類分析+BCA+MLR逍遙散抗抑郁證實柴胡、當歸為君藥,白術為臣藥[35]主要起效成分是低極性組分[36]

2.4.6 PCA+ Hierarchical聚類分析+ BCA+ MLR Hierarchical聚類分析是驗證PCA結果的一種分析方法。它將n個記錄或變量看成是一類，根據接近程度將最相近的兩類合并形成n-1類；在n-1類中重新計算變量間的距離再進行合并，直到所有記錄合并為一類。在譜效研究中，可先采用PCA篩選出主要藥效組分，再用聚類分析加以驗證，最后用BCA和MLR法進行綜合評價。該方法在逍遙散有效化學組分及有效部位最佳配伍篩選研究中得到運用[35-36]。

3 研究缺陷分析

3.1 研究樣本選擇

中藥進入體內經吸收、分布、代謝后起效，起效成分有可能是中藥固有成分、代謝產物、組分間相互作用產物，甚至是藥物所激發的內源性物質。若血中移形成分大部分為中藥固有成分，可選藥物作為研究樣本；但若非固有成分多，則應考慮選用載藥血清作研究樣本。但載藥血清也存在諸多問題，一是 進行組方配伍及有效組分篩選時研究組別多、動物數量大、成本高；二是樣本前處理相對復雜，易造成成分的流失；三是采血量大，不適于用體型過小的動物；四是需要多次采血，對動物的影響不好評估；五是高成本導致實驗不易重復。

3.2 圖譜信息的完整性和精確性

3.2.1 完整性 中藥化學組分繁雜，單張圖譜難以完整反映所有化學特征，若根據單張圖譜進行譜效關系研究，雖可簡化問題，但會出現譜效不對應的情況，故研究應綜合多種圖譜分析結果，建立多源融合指紋圖譜。盡管如此，圖譜中仍然會存在信息的缺失，除儀器分析方法造成的缺失外，樣本本身也會存在信息的缺失。藥物圖譜中缺少體內移形或代謝后的組分信息；而血清圖譜則可能缺少藥物中低含量有效組分的圖譜信息。

3.2.2 精確性 圖譜識別一般需經過樣品識別、譜峰識別、譜峰對齊和譜峰標準化4個步驟，必要時還需手工調整才能完成譜圖的優化與編輯[37]。國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件可被用以協助研究者完成圖譜識別處理。精準的圖譜識別是分析方劑中化學成分歸屬、明確有效成分的關鍵，如果發生偏差譜效分析將失去立足之本。在現階段，中藥組分識別研究仍是一項十分艱巨和浩大的工程。

3.3 藥效模型選擇

中醫診療中“病、證不統一”的現象屢見不鮮，厘清組方方解，對準確選擇藥效模型尤為關鍵。鑒于組方多是多方面、多途徑共同起效，所以一般采用在體試驗為主，配合體外試驗的方式。即便如此，由于目前藥效研究更依賴于化藥的藥效模型，并不能充分、完整地反映中藥的臨床功效。另外功效與療效的量化指標尚無統一標準，這也是中藥譜效研究的缺陷之一。

3.4 數據分析方法的限制

每種統計方法都有其優缺點，均不能完美闡釋中藥的譜效關系，應采用多種統計方法進行綜合分析。但目前譜效研究對統計分析方法的選擇缺乏統一標準，不同統計方法得出的分析結果還可能存在較大差異。在本文所查閱的諸多文獻中，只有藏方甲嘎松湯揮發油體外抗氧化活性的譜效研究1篇文獻用兩種統計方法所得結果一致，其余采用綜合分析法的文獻均報道有差異。由此可見，只有建立起譜效關系研究中數據分析方法的選擇標準，才能保證中藥譜效關系研究的準確性，更進一步推動中藥譜效研究的發展進程。

4 展望

植根于中醫藥傳統理論和實踐經驗的復方中藥，其藥味間以“君臣佐使”相互制約、相互協調而發揮藥效。中藥內在質量、藥效特性、組方配伍不能僅用一種或幾種化學活性成分的變化來闡釋。盡管中藥譜效關系研究還存在諸多缺陷，但不可否認通過中藥譜效相關性的研究，可以揭示復方中藥的配伍規律，篩選有效部位群、表征藥效物質基礎，為進一步闡明中藥藥效作用機制、遴選最佳制備工藝、推動復方中藥的國際化進程提供新的研究導向及途徑。

當今科技已步入智能大數據時代，中藥的國際化之路需要充分利用互聯網優勢，將大數據信息引入中藥臨床和中藥產業發展中[38]。近年來，已有學者投身于中藥指紋圖譜大數據軟件的研制開發，如中藥圖譜文件云服務PaaS模型設計，可解決云計算環境下中藥圖譜數據挖掘過程中難以解決的大數據傳輸效率問題，為圖譜分析系統向云計算環境改造提供高效、安全的解決方案[39]。關于復雜體系及儀器大數據分析的化學計量學軟件ChemPattern的研制應用，不但可以通過標準數據接口技術實現對各類高維、高分辨海量數據的信號處理，還可以用高性能并行計算和大規模數據可視化技術為眾多化學計量學應用提供支持[40]。智能化分析軟件的開發應用必然會進一步推動中藥譜效關系研究的發展，成為該領域研發的最佳助力。

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