雞傳染性支氣管炎病毒LN 株基因組序列測定與致病性分析

阿依古麗·艾班， 程晉龍， 劉曉宇， 張國中

(1.中國農業大學動物醫學院， 北京 海淀 100193；2. 新疆維吾爾自治區呼圖壁縣動物疾病預防控制中心， 新疆 昌吉 831200)

雞傳染性支氣管炎(IB)是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，是目前危害我國養禽業的主要疫病之一。 IBV不僅侵害雞的呼吸系統，還會對泌尿生殖系統造成損傷。 病雞主要表現為呼吸困難、噴嚏、氣管啰音，蛋雞蛋品質和產蛋量下降，病雞可能會由于嚴重的腎臟病變或呼吸道癥狀死亡。 雛雞階段感染IBV，還會對母雞生殖系統造成永久性損傷，對后期產蛋量造成嚴重影響，直接制約養禽業的發展。 1991 年開始，IB 開始在我國大范圍傳播，其中對我國影響較大的是1997 年分離得到的QX 型IBV[1]。 QX 型IBV 主要引起泌尿生殖系統和呼吸系統的損傷。 有研究表明，近年來，與H120 等疫苗相關基因型分離率有所下降，而QX 型IBV 的檢出率逐漸升高[2，3]，說明IBV 在我國的流行依然嚴重。 系統分析IBV各毒株的遺傳演化規律和致病性，對養禽生產中提高對IB 的防控能力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 毒株的繁殖復壯 CK/CH/LN14/01/2014(簡稱LN 株)：由本實驗室從遼寧省某發病雞群中分離獲得。 雞群已免疫過Mass 型相關疫苗。 將病毒在10 日齡SPF 雞胚中進行傳代，至出現穩定胚變，接種40 h 后無菌收取尿囊液，-80 ℃凍存備用。

1.2 實驗動物 SPF 雞與雞胚，均購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，雞飼養在隔離器中。

1.3 主要試劑 dNTP、pMD18-T Easy Vector、DH5α 感受態細胞為TaKaRa 公司產品，購自北京百奧康生物科技公司；M-MLV、Random Primer、RNA 酶抑制劑，購自Promega 公司；2 ×PCR Mix，購自北京威格拉斯生物科技公司；TRIZol，購自Invitrogen 公司；引物合成自上海生工生物技術服務有限公司。

1.4 反轉錄 利用TRIZol 提取RNA，用于反轉錄制備cDNA。 反轉錄體系為20 μL，具體如下：5 ×Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、RNA 酶抑制劑1 μL、M-MLV 反轉錄酶0.5 μL、DEPC 水7.5 μL、Random Primer 1 μL、RNA 模版4 μL；37 ℃1 h，95 ℃5 min。

1.5 PCR 擴增及片段膠回收 利用設計的特異性引物配制PCR 體系，具體如下：cDNA 5 μL、20 μmol/L 上下游引物各1 μL、2 ×PCR Mix 25 μL、無菌雙蒸水18 μL。 瞬時離心混勻后進行如下反應：94 ℃預變性5 min，94 ℃45 s，退火溫度根據引物設定45 s，72 ℃1 kb/min，進行30 個循環，循環結束72 ℃10 min。 凝膠電泳鑒定后，膠回收目的片段。

1.6 PCR 產物克隆測序 按照pMD18-T Easy Vector 連接試劑盒說明書操作，陽性質粒送至北京擎科新業生物技術有限公司進行測序。

1.7 遺傳演化分析 運用Lasergene 7.0、DNAMAN等分析軟件對LN 株和國內其他流行株及經典疫苗株的序列進行比較分析。 應用MEGA5. 1 軟件對LN 株、常用疫苗株與國內近年分離得到的IBV 的基因組序列進行遺傳演化分析，繪制進化樹。

1.8 致病性試驗 將36 只SPF 雞隨機平均分成2組，一組通過滴鼻、點眼的方式攻毒，劑量為105EID50/0.2 mL，另一組作為空白對照。 攻毒后每天觀察雞只表現，記錄臨床癥狀，對死亡雞只及時剖檢，觀察期為14 d。 攻毒后第3、5 天采集氣管、肺臟、腎臟進行固定，用于病理組織學觀察。

2 結果與分析

2.1 IBV 毒株的繁殖與復壯 將IBV LN 株接種10 日齡SPF 雞胚尿囊腔，經連續傳代6 代，已出現穩定胚變，表現為雞胚矮小，蜷縮(見封二彩版圖1)。 EID50經測定[4]為107.0EID50/0.2 mL。

2.2 PCR 擴增 利用設計的特異性引物，對基因組進行擴增，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到LN 株共計29 個基因片段(圖2)。

2.3 基因組序列分析 將PCR 擴增得到的各個基因組片段利用DNAStar 軟件拼接獲得LN 株基因組序列，共27，672 nt，將LN 株與國內外IBV 代表性毒株進行同源性分析。 結果顯示，LN 株與傳統疫苗H120、H52 株的同源性分別為86.3%和86.2%，與國內流行株QX 型IBV JS 株和SD 株同源性分別為96.2%、95.4%，與TW 型IBV GD 株的同源性為94.9%。

圖2 IBV LN 株各片段PCR 產物電泳結果

將LN 株與國內外IBV 毒株進行序列對比并繪制進化樹(圖3)。 從圖中可以看出，IBV 毒株可以劃分為兩個分支，Class Ⅰ分支為我國目前主要的流行毒株，LN 株屬于此分支。 Class Ⅱ分支多為國外經典毒株與疫苗株，兩分支進化關系較遠。

圖3 IBV 全基因組系統進化樹分析

2.4 致病性試驗 攻毒組在攻毒第4 天有1 只雞出現張口呼吸癥狀，第5 天開始出現死亡，持續到第10 天，死亡高峰出現在第5 ～6 天，觀察期間共死亡10 只，死亡率為56%。 LN 組雞只剖檢可見腎臟表面由少量尿酸鹽沉積，氣管有黏液。 死亡雞只病理組織學觀察可見氣管黏膜上皮細胞脫落；支氣管出血；腎臟間質淤血，淋巴細胞浸潤，如封二彩版圖4所示。 空白對照組未觀察到明顯的臨床癥狀、剖檢變化和病理組織學變化。

3 討論

雞傳染性支氣管炎是雞的一種急性、高度接觸性傳染病，可侵害不同日齡的雞群，是目前危害我國養禽業的主要疫病之一。 由于IBV 容易發生變異和重組，不斷出現新血清學和基因型，且不同血清型毒株之間的交叉保護作用較差，因此了解不同地區分離毒株的血清型對于IB 的防控至關重要。 本研究對最近分離到的一株IBV 進行了序列測定，命名為LN 株，并分析了其與國內外流行株的同源性以及致病性。

通過將LN 株與國內外其他IBV 毒株進行基因組序列比對分析，我們發現LN 株屬于QX 型IBV[1]，與常用疫苗株親緣關系較遠。 有研究表明，QX 型IBV 已成為我國目前的主要流行毒株[5]，而且QX 型IBV 與疫苗相關型強毒株IBV 在致病性上有較大的差別。 通過致病性試驗，我們可以看出，IBV LN 株對3 周齡的SPF 雞有較強的致病性，死亡率可以達到56%。 進一步提示了QX 型IBV 對我國養禽業有較大的威脅。 此次研究表明，QX 型IBV在基因組序列和遺傳演化關系上與疫苗株有較大差異，且致病性較強，可能是造成免疫失敗的原因之一，提示我們研發針對QX 型IBV 的疫苗是十分必要的。