上饒地區開展血液核酸篩查應用情況

邱筱椿，王玲玲

(上饒市中心血站，江西 上饒 334000)

目前，臨床輸血治療是一種無法替代的治療手段，有時甚至是搶救生命的首要和必要手段。但是，輸血傳播病毒是臨床輸血安全最大的隱患，盡管采用血清學檢測技術已使輸血傳播疾病的風險得到有效的降低，但仍存在檢測“窗口期”較長、病毒滴度低、免疫靜默性感染和病毒變異等因素，使臨床輸血安全依然存在一定的風險[1]。因為病毒感染人體后會依次經歷復制、轉錄或反轉錄、翻譯3個階段。血液篩查使用的酶聯免疫（ELISA）技術，只能檢測病毒翻譯表達的產物——蛋白質（即抗原或抗體），而對前2個階段的產物——核酸卻無能為力。核酸擴增技術（NAT）具有高靈敏度和特異性及低污染風險的特點。不僅彌補了常規酶聯免疫技術的缺點，而且作為酶聯免疫檢測技術的補充可進一步降低輸血殘余風險，顯著縮短血液感染病毒的檢測“窗口期”。為了進一步提高血液質量的保證輸血安全，本血站于2014年7月對獻血者血液篩查標本開展高靈敏的核酸檢測 （NAT）技術。初步探討NAT應用于本地區無償獻血者血液篩查的必要性。現將2015年1月-2016年8月獻血者血液標本檢測結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2015年1月-2016年8月本血站采集的無償獻血者的血液標本，獻血者均符合國家 《獻血者健康檢測要求》，經體檢和快速篩查（HBsAg、抗-TP、ALT）合格后采集的血液標本共54750例，每位獻血者采集血液同時留取3管血液標本，第1管5ml用EDTA-K2抗凝的真空采血管用于常規ELISA和ALT的檢測，第2管3ml用EDTA-K2抗凝的真空采血管用于血型檢測，第3管5ml用無菌、無DNA酶、無RNA酶帶惰性分離膠的EDTA-K2抗凝的BD真空采血管用于核酸（NAT）檢測，其中NAT檢測標本采集后用低溫冷凍離心機3000r/min離心20min后與2-8℃冰箱保存，并與72h內完成檢測。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 ELISA檢測試劑，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP檢測試劑盒由廈門英科新創科技有限公司和北京萬泰生物藥業股份有限公司提供，ALT檢測試劑盒由上海榮盛科技有限公司和上海科華有限公司提供，乙肝兩對半試劑盒由廈門英科新創科技有限公司提供.核酸檢測試劑.羅氏 Cobas TaqScreen MPx V2.0 HBV、HCV、HIV NAT聯合檢測試劑盒由美國羅氏診斷公司提供，所有試劑均嚴格按試劑盒說明書要求進行操作，并在有效期內使用。

1.2.2 主要儀器 ELISA檢測使用，Hamilton STAR全自動加樣儀和FAME酶免分析儀 （瑞士HAMILTON公司），ALT檢測使用，日立7020全自動生化分析儀（日立公司）。核酸檢測使用羅氏診斷Cobas’S201血液核酸篩查平臺：Hamilton STAR全自動樣儀 （瑞士 HAMILTON公司），Cobas Ampiprep核酸提取儀和Cobas Taqman Ama Lyier核酸擴增檢測儀通過混樣和數據管理服務器(PDM)連接組成血篩平臺。

1．3 檢測流程

1．3．1 常規檢測 所有獻血者標本均按照國家 《獻血者健康檢查要求》進行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、ALT、血型的全項檢測，由不同的檢測人員，采用2種不同廠家的試劑，使用不同的檢測儀器進行2遍全項的平行檢測，嚴格按試劑盒說明書進行操作和判定結果，當標本HBsAg/抗-HCV/抗-HIV/抗-TP/ALT 2種試劑檢測結果均為反應性判為不合格，2種試劑檢測結果均為無反應性則判為合格，若只有一種試劑檢測為反應性的則用該試劑對原血樣做雙孔復試，雙孔復試結果均為無反應性的結果判合格，雙孔復試結果中任何1孔為反應性的結果判為不合格。抗-HIV為反應性的樣本送HIV確認實驗室進行確證，所有試驗均按試劑盒說明書在實驗室管理軟件中編定程序，自動判讀結果。

1．3．2 核酸檢測 對常規檢測合格標本做核酸（NAT）檢測，采用羅氏 Cobas TagScreen MPx Test Version 2.0二代試劑，由全自動混樣儀自動混樣，每 6份標本（167ul/份）混成 1份（1ml）作為一級混樣池（PooL）標本，由全自動核酸提取和全自動核酸擴增儀進行HBV-HCV-HIV NAT檢測，每批檢測均設置1個陰性質控和5個陽性質控（HIV-1 M組 RNA 、HIV-1 O 組 RNA、HIV-2 RNA、HCV RNA、HBV DNA）。每個PooL均含有內對照，如果混樣PooL的檢測為無反應性，則6份標本結果為合格，如果混樣PooL檢測結果為反應性，對該PooL中6份標本進行拆分檢測，單樣本拆分檢測結果作為該樣本最終檢測結果，單樣本的最終拆分檢測可直接區分報告HIV、HCV和HBV病毒為反應性。

1．3．3 NAT陽性獻血者的血清學補充試驗 目前本血站NAT檢測陽性只發現HBV DNA陽性結果，對HBV DNA陽性標本做乙肝兩對半檢測。

2 結果

2.1 2015年1月至2016年8月共采集獻血者標本54750例，其中輸血傳染性指標血清學檢測合格標本為54049例，不合格標本為701例，不合格率為1.28%，具體見表1。

2.2 核酸檢測標本54049例，共檢出HBV DNA陽性139例，陽性反應率為0.26%，具體見表2。

表1 54750例獻血者血清學檢測結果情況

表2 ELISA陰性標本NAT檢測結果

2.3 139例HBV DNA檢測陽性標本經乙肝兩對半檢測結果共有6種模式分別以A-F表示，具體見表3。

表3 139例HBV DNA陽性標本乙肝兩對半檢測模式

3 討論

本血站獻血者輸血傳染性指標血清學檢測的不合格率為1.28%，低于撫州地區4.12%（1631/39599）[2]、新余市 3.78%（1706/45078）[3]和婁底地區3.92%（2427/61929）[4]，這主要是本血站在獻血者采血前的初篩檢測中做了HBsAg、抗-TP和ALT的快速檢測有關。對常規檢測合格的54049例標本進一步用NAT技術檢測，檢出139例陽性標本，陽性檢出率為0.26%，與南昌地區的0.24%（194/79414）[5]和龍巖地區的 0.24%（47/19922）[6]很接近，明顯高于烏魯木齊市的0.11%（62/57644）[7]和常州地區的0.10%（19/17220）[8]。此139例陽性標本均為HBV DNA陽性，未檢出HCV RNA陽性和HIV RNA陽性標本（0/54049）原因分析：可能是①本地區為HCV和HIV的低流行區，②常規ELISA兩種試劑組合互補有效的檢出了HCV和HIV抗體陽性的標本，③HBV是DNA病毒對外界環境的抵抗力較強，而HCV和HIV均為RNA病毒，這與RNA的生物學特性有關[9]，RNA為單鏈病毒，不穩定容易分解和變異，④由于開展NAT檢測時間不長，標本量不夠大，所以未檢測出HCV RNA和HIV RNA陽性標本。表3結果顯示，應用ELISA方法檢測HBsAg陰性而NAT檢測HBV DNA陽性的139例標本乙肝兩對半結果，其中HBcAb陽性占92.08%，HBcAb和HBeAb同時陽性的占41.7%，此現象的發生有可能為HBsAg急性感染的窗口期，亦可能為既往感染過HBV或是急性感染的恢復期，也可能為基因突變形成新的變異株。

終上所述，本次調查表明本地區仍屬我國HBV相對的高流行區，而且隱匿性感染和窗口期的HBV是目前本地區影響酶免陰性血液安全的主要因素，NAT檢測能有效的篩查出ELISA檢測合格為HB-sAg無反應性的HBV感染標本，是確保血液安全的另一種有效的檢測手段。NAT檢測能將窗口期大大縮短[1，10]，其中 HBV 為 6-15d，HCV 為 41-60d，HIV為10-15d。所以在獻血者血液檢測中以ELISA結合NAT檢測在方法學上有很好的互補性，《血站技術操作規程（2015）版》已明確輸血相關傳染病的檢測項目及檢測方法，必須用核酸檢測技術進行HIV RNA、HCV RNA、HBV DNA檢測。采供血機構應選擇合適的核酸檢測系統，加強操作人員的培訓，嚴格遵守操作規程，做好儀器設備的日常維護保養工作及試劑性能確認管理，保證核酸檢測結果的有效性，有效地提高輸血安全，保障臨床用血安全。

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