蝦肝腸胞蟲LAMP檢測方法的建立

孫妍 董學旺 魏俊利 薛淑霞

摘 要 為建立一種快速檢測蝦肝腸胞蟲（EHP）的環介導等溫擴增方法（LAMP），根據GenBank中登錄的EHP-SSU基因序列設計了6條LAMP特異性引物，經反應體系和反應條件的優化，建立了EHP-LAMP檢測方法。該方法的檢出限為3.71個質粒拷貝/μL；與對蝦其他常見病毒病的病原（WSSV、IHHNV、CMNV）均無交叉反應。使用LAMP方法和普通PCR方法對30份具有典型EHP感染癥狀的對蝦樣品進行檢測，結果顯示：LAMP和PCR方法的陽性檢出率均為100%。表明建立的EHP-LAMP方法具有高靈敏度、高特異性、高準確度的優點，適用于生產中對蝦肝腸胞蟲的快速早期診斷，為EHP的防治提供技術支撐。

關鍵詞 對蝦；肝腸胞蟲；環介導等溫擴增；檢測

中圖分類號：S945.4 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.09.058

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器設備

采自天津市東麗區華明街胡張莊村的南美白對蝦樣品，具有典型的EHP感染癥狀，經PCR檢測并測序后確認為EHP感染，由本實驗室保存；經檢測未感染EHP的對蝦基因組、僅感染對蝦白斑病毒（WSSV）的對蝦基因組、僅感染對蝦皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）的對蝦基因組、僅感染偷死野田村病毒（CMNV）的對蝦RNA均由本單位病原檢測室提供；海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（天根生物）；10 mM dNTP、質粒提取試劑盒均購自大連寶生物（TakaRa）；Bst DNA聚合酶（NEB）、鈣黃綠素染料（北京藍譜）、甜菜堿（Sigma）。PCR儀（ABI）、凝膠成像系統（Biometra）、金屬浴（天根生物）、離心機（Sigma）、電泳儀（北京六一）[1]。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設計與合成

根據GenBank發布的EHP基因序列及相關文獻資料，選取EHP-SSU（登錄號：FJ496356.1）為靶基因，按照LAMP引物設計原則，使用在線設計軟件Primer Explorer version 5 （http：//primerexplorer.jp/e）設計6條引物，分別為外引物F3/B3，內引物FIP/BIP和環引物LF/LB，引物由上海生工合成[2]。

1.2.2 LAMP反應條件優化

按照海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取感染EHP對蝦的基因組DNA，作為LAMP擴增反應的模板。EHP-LAMP的基礎反應體系（25μL）：2.5μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，3.5μL 10 mM dNTP，1.5μL 100 mM MgSO4，0.4μL 100 μM FIP，0.4 μL 100 μM BIP，0.2μL 100 μM LF，0.2μL 100μM LB，0.05μL 100 μM F3，0.05μL 100μM B3，8 U Bst DNA聚合酶，1μL鈣黃綠素染料，3μL 5 M甜菜堿，滅菌水適量，2μL模板。基礎反應條件為63 ℃ 60 min，80 ℃ 10 min。為了得到最佳擴增效果，在基礎反應體系上對其可能影響較大的試劑，如甜菜堿、dNTP、MgSO4、Bst DNA聚合酶等的用量以及反應條件進行優化。

1.2.3 LAMP反應體系的靈敏度試驗

將用于EHP-LAMP引物設計的SSU基因序列與pUC57載體連接，構建SSU-pUC57質粒，質粒構建工作由上海生工完成。利用質粒提取試劑盒提取SSU-pUC57質粒，利用核酸檢測儀測定所提取質粒的初始濃度，根據公式：質粒拷貝數/μL=質粒濃度（g/μL）/質粒分子量×阿佛加德羅常數，計算出SSU-pUC57質粒拷貝數為3.71×109，用滅菌水按10倍遞進稀釋法將質粒稀釋至3.71個質粒拷貝/μL，取2μL各濃度稀釋液分別進行LAMP和PCR擴增（以F3/B3為上下游引物進行PCR擴增，產物大小為191 bp），比較兩種方法的最低檢測量。

1.2.4 LAMP反應體系的特異性試驗

將天津市水生動物疫病預防控制中心病原檢測室提供的僅感染WSSV的對蝦基因組、僅感染IHHNV的對蝦基因組、僅感染CMNV的對蝦RNA（反轉錄成cDNA后作為模板）以及感染EHP的對蝦基因組，同時設陰性對照和陽性對照（SSU-pUC57質粒），按照上述建立的LAMP方法進行EHP-LAMP檢測體系的特異性分析。

1.2.5 臨床樣品的檢測

同時利用本研究建立的EHP-LAMP檢測技術和PCR方法，分別對挑選30尾具有典型感染EHP癥狀的對蝦進行檢測，并將這兩種方法得到的結果進行比較。

2 結果

2.1 EHP-LAMP的優化結果

經試驗結果綜合分析，發現甜菜堿、MgSO4和dNTP的加入量對EHP-LAMP反應體系的擴增效率影響較大。最終確定EHP-LAMP的最佳反應體系為：2.5 μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，2.5 μL 10 mM dNTP，2 μL 100 mM MgSO4，0.4 μL 100 μM FIP，0.4 μL 100 μM BIP，

0.2 μL 100 μM LF，0.2 μL 100 μM LB，0.05 μL 100μM F3，0.05 μL 100μM B3，8 U Bst DNA聚合酶，1 μL鈣黃綠素染料，1 μL 5M甜菜堿，2 μL模板滅菌水定容總體積至25 μL。反應條件為63 ℃ 40 min，80 ℃ 5 min。

2.2 靈敏度試驗結果

利用優化條件后的EHP-LAMP和PCR檢測方法對不同稀釋倍數的模板進行擴增，結果顯示：LAMP檢測方法的檢出限為3.71個質粒拷貝/μL，PCR檢測方法的檢出限為371個質粒拷貝/μL，LAMP檢測方法的靈敏度高于PCR。

2.3 特異性試驗結果

利用優化條件后的EHP-LAMP反應體系對含有WSSV、IHHNV、CMNV和EHP的對蝦基因組及SSU-pUC57質粒進行檢測，結果顯示：只有含有EHP對蝦基因組和SSU-pUC57質粒出現陽性擴增，而含有WSSV、IHHNV和CMNV的對蝦基因組以及陰性對照檢測結果為陰性，表明建立的EHP-LAMP方法與對蝦其他常見病毒病的病原均無交叉反應，特異性良好。

2.4 臨床樣品檢測結果

利用優化條件后的EHP-LAMP和PCR方法分別對30份具有典型EHP感染癥狀的對蝦樣品進行檢測，同時設立陽性和陰性對照。結果顯示：EHP-LAMP和PCR方法的陽性檢出率均為100%，其中5份樣品PCR檢測條帶較弱，為弱陽性。

3 討論

EHP屬于微孢子蟲，其個體小于細胞，很難通過顯微鏡觀察到，重癥感染的對蝦肝胰腺在常規蘇木精-伊紅（HE）染色下也很難觀察到特征性病理變化，而通過原位雜交則能顯示對蝦感染EHP后其肝胰腺小管上皮細胞中存在明顯雜交信號，因此分子檢測是微孢子蟲的有效檢測手段。目前，相關EHP檢測方法主要包括實時熒光定量PCR法、普通PCR法、巢式PCR法等，而這些檢測手段需要專業的技術操作人員和在專業的分子實驗室中才能完成。我國2013—2015年的養殖對蝦EHP攜帶情況調查數據顯示，EHP具有較高的陽性檢出率，已成為導致對蝦生長緩慢的主要病原。EHP主要侵染蝦苗和幼蝦，且在感染早期沒有明顯癥狀，在購買苗種的時候很難引起人們的注意，嚴重影響了蝦農的經濟收益。因此，建立一種快速、簡便、適用于實際生產的EHP檢測方法十分必要。基于此，根據環介導等溫擴增（LAMP）原理，基于SSU基因設計6個引物，建立了快速檢測EHP的LAMP方法。該方法僅35～40 min即可達到反應的平臺期；對反應裝置要求較低，恒溫水浴鍋、金屬浴或PCR儀均能作為LAMP的恒溫反應裝置，非常適用于在生產一線使用；結果觀察簡單，反應完畢用肉眼觀察反應液的顏色變化即可判斷結果；特異性良好，與對蝦常見病毒均無交叉反應；靈敏度是普通PCR方法的100倍。通過30份樣品的檢測結果比較發現，LAMP法與PCR法的檢測結果符合率為100%，PCR法檢測結果為弱陽性的樣品，LAMP法的檢測結果仍然為陽性，與其他陽性樣品的顯色并無差異，證明LAMP法的準確率高且比PCR法更加靈敏。

EHP具有垂直傳播和水平傳播兩種感染方式，且與其他疾病的重要區別是EHP可以通過同類間的殘食實現水平傳播，這使得控制養殖池中的疾病擴散變得尤為困難，截至目前還沒有治療該疾病的藥物。因此養殖過程中需要認真關注重要的易感染環節，從苗種的檢測、飼料的檢測、餌料的控制、水體等方面控制EHP的傳播和發病。上述建立的EHP-LAMP法滿足了對蝦養殖中對EHP快速檢測的需要，為EHP的早期診斷以及防控技術研究和效果評估等方面提供了技術支撐。

參考文獻：

[1] 駱云慧，石堅，方磊，等.蝦肝腸胞蟲TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫科學，2016，46（7）：847-852.

[2] 王博雅，王力，劉美如，等.凡納濱對蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區的流行情況分析[J].大連海洋大學學報，2017，32（2）：150-154.

（責任編輯：劉昀）