DC-GPC3聯合CIK細胞的體外抗肝癌作用

韓秋青 ，姜錦 ，王玉亮

肝癌是全球第五大惡性腫瘤，具有很高的發病率和死亡率，全球每年約有62萬患者被新診斷為肝癌［1］。由于中國人群中的慢性乙型肝炎病毒感染率較高，使得我國占到了世界所有新診斷肝癌病例的55%，成為全世界肝癌最高發的地區之一［2］。目前抗腫瘤生物免疫治療模式在國內外備受關注，其對于清除微小的轉移灶和隱匿瘤，預防腫瘤的復發和轉移有較好的效果［3］。既往研究發現通過體外誘導的樹突狀細胞（dendritic cells，DC）與細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer cells，CIK）共孵育，可以有效提高CIK細胞的增殖能力及廣譜抗腫瘤能力［4］，但缺乏特異識別腫瘤細胞的特性。研究顯示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC3）可作為一個新的肝癌診斷、判斷預后的生物標志物，以及肝癌生物免疫治療新的靶點［5］。本研究擬將GPC3基因轉染DC所得到的DC-GPC3與CIK共培養，觀察其生物活性及體外抗肝癌作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌細胞株HepG2和SK-Hep-1，白細胞介素（IL）-2依賴細胞株CTLL-2由衛生部危重病急救醫學重點實驗室于液氮凍存。人DC、DC-GPC3及CIK由衛生部危重病急救醫學重點實驗室于液氮凍存。RPMI 1640培養基（美國GIBCO公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；重組粒單-集落刺激因子（GM-CSF）、IL-4、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-2、抗 CD3 單抗、異硫氰酸熒光素/藻紅蛋白（FITC/PE）標記的鼠抗人CD單抗（美國BD公司）；IL-2、干擾素γ（IFN-γ）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測試劑盒（美國Promega公司）。FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；CO2培養箱（美國Thermo公司）；凈化工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；多模式微孔板檢測儀（美國PE公司）。

1.2 流式細胞術檢測人DC、DC-GPC3以及CIK免疫表型 復蘇液氮罐凍存人DC、DC-GPC3及CIK，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，調整細胞濃度至5×106細胞/mL，按各流式抗體試劑說明書操作，檢測DC、DC-GPC3及 CIK 特異表面標志：DC（CD80、CD83、CD86）、CIK（CD3+CD8+、CD3+CD56+）。

1.3 DC和CIK細胞共培養 以DC-GPC3與CIK細胞按1∶5的比例混合，接種于細胞培養板，置于37℃、5%CO2孵箱中培養48 h，獲得DCIK-GPC3作為實驗組，調整細胞濃度為2×107/mL；以DC與CIK細胞按1∶5的比例混合，接種于細胞培養板，置于37℃、5%CO2孵箱中培養48 h，獲得DCIK作為對照組，調整細胞濃度為2×107/mL。同時設單獨培養的CIK細胞作為空白對照組，動態觀察細胞形態。

1.4 流式細胞術檢測人CIK、DCIK及DCIK-GPC3免疫表型 按各流式抗體試劑說明書操作，檢測CIK、DCIK及DCIK-GPC3特異表面標志CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細胞。

1.5 MTT法檢測細胞培養上清液中IL-2生物活性 取對數生長期IL-2依賴細胞株（CTLL-2），用完全培養液調整細胞濃度1×106/mL，加入96孔細胞培養板，每孔加入100μL，每孔分別加入CIK、DCIK及DCIK-GPC3細胞培養上清液50μL或稀釋的IL-2標準品，并設3個平行孔，以1640培養液做陰性對照。細胞培養24 h后，加入20μL MTT（5 g/L），再培養4 h，用DMSO溶解孔中活細胞產生的甲瓚結晶，待結晶完全溶解后將96孔細胞培養板置于多模式微孔板檢測儀，測定570 nm波長處各孔的光密度（OD）值，根據稀釋IL-2標準品OD值繪制標準曲線，以標準品IL-2活性單位作橫坐標，OD值作縱坐標，計算出各組細胞培養上清液IL-2生物活性。

1.6 細胞培養上清液中IL-2、IFN-γ濃度檢測 使用ELISA試劑盒測定CIK、DCIK及DCIK-GPC3細胞培養上清液IL-2、IFN-γ濃度，按照說明書操作。

1.7 細胞毒活性測定 分別以DCIK-GPC3、DCIK及CIK作為效應細胞，以對數生長期GPC3陽性的HepG2作為靶細胞，效應細胞與靶細胞按20∶1、50∶1比例混合接種于96孔細胞培養板，37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h后，采用LDH釋放法按操作說明書檢測效應細胞的細胞毒活性。同時以對數生長期GPC3陰性的SK-Hep-1作為對照靶細胞，與DCIK-GPC3、DCIK按1∶20比例混合，采用LDH釋放法檢測細胞毒活性。

1.8 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗；2組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DC及DC-GPC3免疫表型 DC表面CD80陽性細胞所占比例為82%，CD83陽性細胞所占比例為78%，CD86陽性細胞所占比例為86%；DC-GPC3表面CD80陽性細胞所占比例為83%，CD83陽性細胞所占比例為80%，CD86陽性細胞所占比例為87%，見圖 1。

Fig.1 The phenotypic characteristics of DC and DC-GPC3圖1DC及DC-GPC3免疫表型

2.2 各組效應細胞免疫表型 DCIK-GPC3表面CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細胞百分比較DCIK及CIK明顯增高，差異有統計學意義（F分別為39.983、65.371，P＜0.01），見圖 2。

2.3 各組效應細胞分泌IL-2生物活性及濃度檢測 各組效應細胞分泌IL-2生物活性及濃度水平差異有統計學意義（F分別為31.414、110.780，P＜0.01），CIK、DCIK、DCIK-GPC3 培養上清液分泌 IL-2生物活性及濃度依次升高，組間多重比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖 3、4。

Fig.2 The phenotypic characteristics of effector cells圖2 各組效應細胞免疫表型

Fig.3 The biological activity of secreted IL-2 of effector cells in supernatants圖3 各組效應細胞培養上清液分泌IL-2生物活性

Fig.4 The concentration of secreted IL-2 of effector cells in supernatants圖4 各組效應細胞培養上清液分泌IL-2濃度

2.4 各組效應細胞分泌IFN-γ濃度比較 各組效應細胞分泌IFN-γ濃度差異有統計學意義（F=30.636，P＜0.01）。CIK、DCIK、DCIK-GPC3 培養上清液分泌IFN-γ濃度依次升高，組間多重比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

Fig.5 The concentration of secreted IFN-γ of effector cells in supernatants圖5 各組效應細胞培養上清液分泌IFN-γ濃度

2.5 各組效應細胞對肝癌細胞毒活性比較 在20∶1及50∶1效靶比，各組效應細胞對GPC3陽性的HepG2細胞毒活性差異有統計學意義（F分別為28.127、34.088，P＜0.01），CIK、DCIK、DCIK-GPC3對HepG2細胞的細胞毒活性依次升高，組間多重比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖6。而在20∶1效靶比，DCIK-GPC3對 GPC3陰性的 SKHep-1細胞的細胞毒活性與DCIK比較差異無統計學意義（34.5%±3.1%vs.35.5%±3.7%，n=4，t=0.414，P＞0.05）。

Fig.6 The cytotoxic activity against HepG2 of effector cells圖6 各組效應細胞對HepG2細胞的細胞毒活性

3 討論

3.1 GPC3作為肝癌治療靶點 近年國內外研究已證實，GPC3可成為一個新的肝癌診斷、判斷預后的生物標志物，以及肝癌生物免疫治療新的靶點［5］。如Bi等［6］將人源化抗GPC3抗體的單鏈可變片段與抗CD3抗體融合來制備靶向GPC3和CD3雙特異性T細胞誘導劑，結果顯示，其在體內外高效、特異性殺傷GPC3陽性表達的人類肝癌細胞。Sawada等［7］進行了 GPC3 肽疫苗作為肝細胞肝癌（HCC）患者的輔助治療的Ⅱ期臨床試驗，結果顯示，手術加疫苗接種的HCC患者術后復發率低于單純接受手術的患者。GPC3肽疫苗可降低GPC3陽性腫瘤患者的1年復發率。因此，以GPC3為分子靶點的治療是HCC治療的有希望的候選方法。

3.2 DCIK-GPC3免疫表型 DCIK是DC與CIK共培養獲得的一群異質效應細胞，成熟DC抑制了CD4+CD25+Treg細胞，后者可以明顯抑制CIK中的CD3+CD8+和CD3+CD56+效應細胞發揮活性。加入DC可以有效消除這種免疫抑制效應，DCIK細胞的增殖以及殺傷活性明顯增強。因此，將CIK和DC聯合治療惡性腫瘤，將有助于解除部分腫瘤患者T細胞的免疫無能，從而發揮協同抗腫瘤作用［8-9］。CIK表型以CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細胞為主，本實驗結果顯示，DCIK-GPC3免疫表型CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細胞百分比較DCIK及CIK細胞明顯增高，這表明DC-GPC3和CIK細胞之間存在很重要的免疫調節關系，CIK細胞可以識別成熟的DC-GPC3，DC-GPC3又可以促進CIK效應細胞數量增多，這可以保證了DCIK-GPC3細胞具有更強的細胞毒活性。

3.3 DCIK-GPC3體外抗肝癌作用 本課題組前期研究證實，DCIK-GPC3效應細胞可明顯抑制肝癌移植瘤生長［10］，在此基礎上，本實驗研究結果顯示，隨著效應細胞與靶細胞比例增加，各組對GPC3陽性的HepG2細胞的細胞毒性顯著增加；在相同效靶比條件下，DCIK-GPC3、DCIK對HepG2細胞的細胞毒活性較CIK顯著提高，其中以DCIK-GPC3的細胞毒活性最為顯著。進一步在相同效靶比條件下，DCIK-GPC3對GPC3陰性的SK-Hep-1細胞的細胞毒活性與DCIK相比并無顯著增高。這提示靶向GPC3的DCIK-GPC3對肝癌細胞的殺傷效應依賴GPC3分子的表達，具有較高的特異性，對高表達GPC3抗原肝癌細胞有更強的殺傷能力，從而彌補了DCIK非特異性殺傷的不足。本研究結果顯示，與DCIK及CIK相比，DCIK-GPC3培養上清液中IL-2生物活性、濃度以及上清液中IFN-γ濃度水平均顯著升高，提示DCIK-GPC3高效釋放的生物活性物質IL-2及IFN-γ可正反饋促進DCIK-GPC3的高度活化，從而顯著增強CIK效應細胞對肝癌細胞的特異性直接殺傷作用。

總之，CIK與DC-GPC3共培養可獲得更強的特異性殺傷肝癌細胞活性，本研究為DCIK-GPC3治療肝癌的臨床轉化提供了理論和實驗依據。

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