慢病毒載體介導的bFGF基因轉染兔BMSCs的實驗研究

張槐，彭吾訓，劉鋼，張健，張飛，王健波，趙胤，李青

骨髓基質干細胞（BMSCs）是骨組織工程研究中首選的種子細胞，該細胞易向成骨方向誘導和分化，近年來由于其強增殖力和具有多向分化潛能，在干細胞研究中引起廣泛關注［1］。但BMSCs定向分化需要合適的細胞因子調控，而且在體內移植過程中，細胞存活率低下［2］。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）是成纖維細胞生長因子家族的基本成員，能促進BMSCs遷移、增殖和分化［3］，也是一種強大的毛細血管增殖刺激劑，能為BMSCs生長提供充足的血供和營養,但局部使用時存在諸多問題，如半衰期短、使用劑量大和價格昂貴等［4］。目前，隨著轉基因技術的不斷發展，通過轉基因改造干細胞已成為干細胞移植領域的研究熱點［5］。本研究利用慢病毒載體將bFGF基因轉染到BMSCs中，探討bFGF基因轉染對BMSCs生物學特性的影響，并獲得持久過表達bFGF的BMSCs，可能為上述問題的解決提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。4～6周齡清潔級新西蘭大白兔4只，由貴州醫科大學動物中心提供，體質量1.0～1.5 kg。（2）主要材料與試劑。3%戊巴比妥鈉（MERCK公司，德國），Percoll分離液、堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒、嘌呤霉素、CCK-8溶液（北京索萊寶生物科技有限公司），ALP分析試劑盒（BioAssay Systems，美國），茜素紅染色試劑盒、成骨誘導培養基（廣州賽業生物科技有限公司），細胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物科技有限公司），bFGF基因過表達慢病毒和慢病毒陰性對照（上海吉凱基因科技有限公司），bFGF、ACTB（內參）引物、cDNA合成試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，Anti-CD44/FITC、兔抗兔Anti-bFGF、兔抗兔Antiβ-actin、山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs分離培養及鑒定 以3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，常規消毒鋪巾，在兔股骨遠端及脛骨近端穿刺，以預存肝素的注射器抽取骨髓液1～2 mL，再用PBS制成單細胞懸液。采用密度梯度離心法分離細胞后，完全培養基重懸，以細胞密度為1×105/mL接種3 mL于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態及貼壁情況，當細胞接近80%～90%融合時，加入胰酶按1∶3消化傳代。細胞傳至第3代時，應用流式細胞儀檢測BMSCs細胞表面標志物（CD44）的表達；采用成骨誘導培養基誘導BMSCs成骨分化，于誘導培養第14天，應用ALP染色和茜素紅染色鑒定其成骨分化潛能。

1.2.2 過表達bFGF基因慢病毒載體構建 過表達bFGF基因慢病毒載體由上海吉凱基因科技有限公司構建，載體中包含嘌呤霉素抗藥基因，見圖1。

1.2.3 載有bFGF基因的慢病毒轉染BMSCs及篩選 （1）取第3代BMSCs，調整細胞密度為1×105/mL，取2 mL接種于25 cm2培養瓶中，待細胞匯合約30%時，以預實驗中最佳轉染復數（50）進行轉染，根據轉染條件分為bFGF轉染組、空病毒組及未轉染組。10 h后更換新鮮培養基，每天鏡下觀察細胞生長情況，轉染3 d后于倒置熒光顯微鏡下觀察增強型綠色熒光蛋白（EGFP）表達情況。（2）當細胞匯合度約80%～90%時，將細胞1∶3傳代。次日加入含嘌呤霉素（2 mg/L）的培養基篩選，每2 d更換1次，待未轉染組細胞全部死亡時，將嘌呤霉素減至1 mg/L，維持篩選。

Fig.1 The lentiviral vector(GV367)and clone site icon圖1 慢病毒載體（GV367）及克隆位點圖譜（MCS為多克隆位點）

1.2.4 RT-PCR和Western blot分別檢測bFGF表達 Trizol法提取細胞總RNA，經逆轉錄擴增后進行RT-PCR反應：95℃預變性3 min；95℃變性 3 s，60℃退火/延伸30 s，共40個循環，引物序列見表1。依據檢測所得各組Ct值結果，計算2-ΔΔCt值來表示各組bFGF mRNA相對表達水平。細胞裂解提取各組細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，并調整蛋白濃度一致后，煮沸變性，然后依次進行電泳、轉膜、封閉。封閉完成后，分別加入目的一抗Anti-bFGF（1∶300稀釋）、內參一抗 Anti-β-actin（1∶7 500稀釋），4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶7 500稀釋）室溫孵育1 h，最后進行化學顯影，所得條帶采用凝膠圖像處理系統分析圖像。β-actin作為內參蛋白，以bFGF蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達量。

Tab.1 The RT-PCR primer sequences of bFGF/ACTB表1bFGF、ACTB RT-PCR引物序列

1.2.5 CCK-8法檢測轉染細胞的增殖特性 取bFGF轉染組、空病毒組第3代細胞及未轉染組細胞，以2×104/mL（100μL/孔）接種于7塊96孔板中，各組設3個復孔，置于培養箱中培養。于每天同一時間取一板檢測，檢測前更換新培養基后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于培養箱內孵育3 h，在450 nm測定光密度（OD）值，根據結果描繪細胞增殖曲線。

1.2.6 細胞增殖周期的測定 取bFGF轉染組、空病毒組及未轉染組對數生長期的細胞，PBS液洗滌2次，調整細胞密度為1×106/mL，取1 mL加入流式管中，離心后加入500μL 70%冷乙醇重懸，4℃過夜。PBS洗滌2次，加入100μL RNase A重懸，37℃溫育30 min，加入400μL PI染液混勻，4℃避光30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.7 ALP活性檢測 取bFGF轉染組、空病毒組及未轉染組細胞，調整細胞密度為2×104/mL，以1 mL/孔接種于24孔板中，加入成骨誘導培養基后置于培養箱中培養。于培養第7、14、28天，應用ALP分析試劑盒檢測各組ALP的活性。

1.3 統計學方法 使用SPSS 22.0統計學軟件分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較應用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs的培養與基因轉染情況 采用密度梯度離心法聯合貼壁培養法，獲得大量形態均一的BMSCs（圖2A），細胞呈旋渦狀生長，形狀呈長梭形、多角形。細胞表面抗原CD44陽性率達99%以上（圖3）；成骨誘導培養第14天，茜素紅、ALP染色均呈陽性（圖2B、C）?；蜣D染后，發現bFGF轉染組、空病毒組、未轉染組在形態學上無明顯差異（圖2D～F）。于轉染后第4天，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白表達率達90%以上（圖2G、H）。傳代后以2 mg/L嘌呤霉素篩選，篩選第3天出現細胞克隆，篩選第6天時未轉染組細胞全部死亡，此時轉染組細胞克隆匯合達80%～90%，挑取細胞克隆擴大培養。

2.2 各組細胞bFGF基因、蛋白表達比較 RTPCR檢測結果顯示，bFGF轉染組mRNA表達明顯高于其他2組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），空病毒組與未轉染組比較差異無統計學意義，見圖4A。Western blot檢測結果顯示bFGF轉染組、空病毒組與未轉染組均在17 ku處出現特異性條帶（圖5），其中bFGF轉染組bFGF表達較其他2組顯著增強，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖4B。

2.3 基因轉染后細胞增殖能力和細胞周期的變化情況 bFGF基因轉染后，細胞增殖曲線明顯變陡，除1 d時，各組間OD值差異無統計學意義外，之后各時間點bFGF轉染組OD值均高于其他2組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。流式細胞儀檢測各細胞增殖周期結果，bFGF轉染組G0/G1期的細胞比例較其他2組降低，而在S期與G2/M期，bFGF轉染組細胞比例均較其他2組增高，并且bFGF轉染組細胞周期指數（PrI）在3組中最高（均P＜0.05）。各期中，未轉染組與空病毒組比較，差異無統計學意義，見圖7。

2.4 各組細胞ALP活性的比較 各組細胞中ALP活性在第14天時達到高峰，隨后下降，其中bFGF轉染組ALP活性在各時間點均高于空病毒組與未轉染組（均P＜0.05），見圖 8。

Fig.2 BMSCs culture and gene transfection圖2 BMSCs的培養與基因轉染情況

3 討論

本研究采用BMSCs作為靶細胞，BMSCs是一種多能干細胞，易在體外分離和培養［6］，并具有成骨分化潛力和較強的增殖能力［7］，在眾多研究中已證實其在骨形成中起重要作用［8］，因此被認為是用于骨組織工程的良好種子細胞［9］。獲取BMSCs的方法主要包括流式細胞術分離法、全骨髓培養法和密度梯度離心結合貼壁培養法。王雪等［10］應用Percoll密度梯度離心法結合貼壁培養法獲得大量形態均一的 BMSCs，流式細胞儀檢測 CD44陽性率達99.96%，與本研究一致，證實采用密度梯度離心法結合貼壁篩選法獲取高純度的BMSCs是可行的。

Tab.3 Results of BMSCs surface antigen CD44圖3 BMSCs表面抗原CD44檢測結果

Fig.4 Comparison of bFGF mRNA and protein expression levels between three groups(n=3)圖4 3組細胞的bFGF mRNA、蛋白表達水平比較（n=3）

Fig.5 The protein expressions of bFGF in three groups圖5 3組細胞bFGF蛋白表達

Fig.6 Changes of cell proliferation after bFGF gene transfection in three groups圖6 bFGF基因轉染后3組細胞增殖能力的變化

Fig.7 Changes of cell proliferation cycles after bFGF gene transfection in three groups圖7 bFGF基因轉染后3組細胞增殖周期的變化

Fig.8 Comparison of ALP activities between three groups圖8 各組細胞ALP活性比較

bFGF是成纖維細胞生長因子家族的成員之一，在細胞增殖和分化中起重要作用［11］。Du 等［12］研究表明bFGF有明顯增強BMSCs增殖的能力，具有保持成骨的能力，能刺激血管再生，促進干細胞在體內的存活［13］。在本實驗中，將bFGF基因成功導入BMSCs，通過RT-PCR和Western blot檢測到bFGF轉染組mRNA及蛋白表達量均高于空病毒組、未轉染組，證明bFGF基因成功過表達。崔利德等［14］研究中利用腺病毒載體將bFGF基因導入BMSCs中，目的基因成功表達，與本研究結果一致。

本研究應用慢病毒載體將bFGF基因轉入BMSCs，相對質粒、腺病毒等載體而言，慢病毒具有目的基因表達時間長、低細胞毒性、低免疫原性、轉染效率高等優點，因此成為組織工程基因改造最具潛力的載體之一［15-16］。將含有bFGF基因的慢病毒轉染BMSCs后，通過細胞形態學觀察、細胞增殖曲線、細胞周期及ALP檢測來觀察其對BMSCs生物學特性的影響，結果發現在形態學上3組比較無明顯差異，表明慢病毒轉染對BMSCs本身無明顯影響，這與Kraus等［17］的研究一致。在bFGF轉染組中，細胞增殖分裂能力明顯強于空病毒組與未轉染組，可能是bFGF促進了BMSCs的增殖。目前bFGF促進細胞增殖的機制尚不明確，Zhang等［18］研究認為可能與bFGF促進pAKT和pGSK3β的升高有關。ALP能夠直接反映成骨細胞早期分化的程度，是骨形成的特異性指標［19］，因此眾多學者通過檢測ALP活性來觀察BMSCs的成骨效應［20］。本研究中，bFGF轉染組ALP活性明顯增強，表明bFGF促進了BMSCs的成骨分化。

綜上所述，本實驗通過慢病毒載體將bFGF基因成功導入BMSCs，目的基因得到表達，轉染后細胞增殖能力與成骨分化能力明顯增強，并證實慢病毒轉染對BMSCs本身無明顯影響。在Zhang等［21］的研究中，成功將bFGF基因導入BMSCs中，并證實其能促進骨折愈合，這表明bFGF基因轉染的BMSCs有望成為一種新的方法應用于骨折、骨缺損的治療。本研究僅在體外培養條件下探討了bFGF基因轉染對BMSCs生物學特性的影響，其在體內成血管效應及對骨折、骨缺損修復效果如何，仍需進一步探索。

［1］Wang JJ，Liu YL，Sun YC，et al.Basic fibroblast growth factor stimulates the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in giant panda（Ailuropoda melanoleuca）［J］.PLoS One，2015，10（9）：e0137712.doi：10.1371/journal.pone.0137712.

［2］Khan I，Ali A，Akhter MA，et al.Preconditioning of mesenchymal stem cells with 2，4-dinitrophenol improves cardiac function in infarcted rats［J］.Life Sci，2016，162：60-69.doi：10.1016/j.lfs.2016.08.014.

［3］Wang X，Zhen L，Miao H，et al.Concomitant retrograde coronary venousinfusion ofbasic fibroblastgrowth factorenhances engraftment and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells for cardiac repair after myocardial infarction［J］.Theranostics，2015，5（9）：995-1006.doi：10.7150/thno.11607.

［4］Yang Y，Jin G，Li L，et al.Enhanced osteogenic activity of mesenchymal stem cells and co-modified BMP-2 and bFGF genes［J］.Ann Transplant，2014，19（1）：629-638.doi：10.12659/AOT.892461.

［5］Xu J，Lu H，Miao ZN，et al.Immunoregulatory effect of neuronallike cells in inducting differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（24）：5041-5048.

［6］Zhu L，Liu YJ，Shen H，et al.Astragalus and baicalein regulate inflammation of mesenchymal stem cells（MSCs）by the mitogenactivated protein kinase （MAPK）/ERK pathway［J］.Med Sci Monit，2017，23：3209-3216.

［7］Luo G，Huang Y，Gu F.rhBMP2-loaded calcium phosphate cements combined with allogenic bone marrow mesenchymal stem cells for bone formation［J］.Biomed Pharmacother，2017，92：536-543.doi：10.1016/j.biopha.2017.05.083.

［8］Liu X，Bao C，Xu HHK，et al.Osteoprotegerin gene-modified BMSCs with hydroxyapatite scaffold for treating critical-sized mandibular defects in ovariectomized osteoporotic rats［J］.Acta Biomater，2016，42：378-388.doi：10.1016/j.actbio.2016.06.019.

［9］Luo G，Gu F，Zhang Y，et al.Icariside II promotes osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells in beagle canine［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（5）：4367-4377.

［10］王雪，楊婧，袁紅，等.丹參素冰片酯對同型半胱氨酸誘導大鼠骨髓間充質干細胞損傷的保護作用及機制［J］.中華心血管病雜志，2017，45（2）：130-136.Wang X，Yang J，Yuan H，et al.Protective effect and related mechanism of tanshinol borneol ester on homocysteine induced rat bone marrow mesenchymal stem cells damage［J］.Chin J Cardiol，2017，45（2）：130-136.doi：10.3760/cma.j.issn.0253-3758.2017.02.012.

［11］Xu W，Wang X，Xu G，et al.Basic fibroblast growth factor expression is implicated in mesenchymal stem cells response to light-induced retinal injury［J］.Cell Mol Neurobiol，2013，33（8）：1171-1179.doi：10.1007/s10571-013-9983-y.

［12］Du M，Zhu T，Duan X，et al.Acellular dermal matrix loading with bFGF achieves similar acceleration of bone regeneration to BMP-2 via differential effects on recruitment，proliferation and sustained osteodifferentiation of mesenchymal stem cells.［J］.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2017，70（Pt1）：62-70.doi：10.1016/j.msec.2016.08.049.

［13］Xu Y，Fu M，Li Z，et al.A prosurvival and proangiogenic stem cell delivery system to promote ischemic limb regeneration［J］.Acta Biomater，2016，31：99-113.doi：10.1016/j.actbio.2015.12.021.

［14］崔利德，李鐵民.堿性成纖維細胞生長因子基因修飾骨髓間充質干細胞移植修復急性腎損傷［J］.中國組織工程研究，2016，20（28）：4169-4175.Cui LD，Li TM.Basic fibroblast growth factortransfected bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for acute kidney injury［J］.Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2016，20（28）：4169-4175.doi：10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.010.

［15］劉偉，王杰，幸永明，等.綠色熒光蛋白標記SOX9基因慢病毒載體的構建及在兔骨髓間充質干細胞中的表達［J］.中國實驗診斷學 ，2017，21（1）：140-145.Liu W，Wang J，Xing YM，et al.Construction of a SOX9 gene recombinant lentivirus vector marked by green fluorescent protein and it’s expression in rabbit bone marrow derived mesenchymal stem cells［J］.Chin J Lab Diagn，2017，21（1）：140-145.doi：10.3969/j.issn.1007-4287.2017.01.055.

［16］Ortinski PI，O'Donovan B，Dong X，et al.Integrase-deficient lentiviral vector as an all-in-one platform for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing［J］.Mol Ther Methods Clin Dev，2017，5：153-164.doi：10.1016/j.actbio.2015.12.021.

［17］Kraus TM，Imhoff FB，Reinert J，et al.Stem cells and bFGF in tendon healing：Effects of lentiviral gene transfer and long-term follow-up in a rat Achilles tendon defect model［J］.BMC Musculoskelet Disord，2016，17：148.doi：10.1186/s12891-016-0999-6.

［18］Zhang X，Li J，Ye P，et al.Coculture of mesenchymal stem cells and endothelial cells enhances host tissue integration and epidermis maturation through AKT activation in gelatin methacryloyl hydrogel-based skin model［J］.Acta Biomater，2017，59：317-326.doi：10.1016/j.actbio.2017.07.001.

［19］周航宇，夏德林，甘生遠，等.骨形態發生蛋白2和血管內皮生長因子165雙基因轉染骨髓基質干細胞的異位誘導成骨能力［J］.中國組織工程研究，2017，21（9）：1334-1339.Zhou HY，Xia DL，Gan SY，et al.Ectopic osteogenesis of bone marrow stromal stem cells under bone morphogenetic protein 2/vascular endothelial growth factor 165 co-transfections［J］.Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2017，21（9）：1334-1339.doi：10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.005.

［20］Chen YX，Zhu DY，Xu ZL，et al.The protective effect of cordycepin on alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head［J］.Cell Physiol Biochem，2017，42（6）：2391-2403.doi：10.1159/000480181.

［21］Zhang H，Kot A，Lay YE，et al.Acceleration of fracture healing by overexpression of basic fibroblast growth factor in the mesenchymal stromal cells［J］.Stem Cells Transl Med，2017，6（10）：1880-1893.doi：10.1002/sctm.17-0039.