曲美他嗪對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌自噬水平的影響

譚淑娜，馮津萍，馮超，田翠燕，陳樹濤

心力衰竭（心衰）是心臟各種疾病的終末階段，5年生存率只有50%左右，尋找新的治療方案成為亟待解決的問題［1］。自噬是依賴溶酶體途徑對體內受損細胞器及大分子物質進行降解的過程，受多個自噬相關基因（Atg）如 Beclin-1、Atg7、Atg5、Atg14 等的調控。自噬相關蛋白LC3BⅡ與P62的表達水平反映自噬水平的高低，其中自噬底物蛋白P62與自噬活性呈負相關［2］。最近研究表明，自噬亦存在于心衰心肌細胞中，但其對心臟的影響尚不明確［3］。曲美他嗪為長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶（3-KAT）抑制劑，可用于心力衰竭的治療［4］，但其與自噬關系的研究較少。本研究通過檢測心衰及應用曲美他嗪后大鼠心功能、心肌組織病理及自噬指標等的變化，探討自噬對心肌細胞的作用及曲美他嗪對心肌自噬水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SPF級成年雄性Wistar大鼠30只，體質量210～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。曲美他嗪（天津施維雅制藥有限公司）；水合氯醛（索萊寶化學試劑公司）；超聲系統氣體麻醉裝置、Vevo2100小動物超聲儀（加拿大VisualSonics公司）；PV-Loop壓力-容積系統（上海然哲儀器設備有限公司）；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢優爾生科技股份公司）；兔抗鼠LC3B、GAPDH、P62一抗（Abcam公司），山羊抗兔LC3B、GAPDH、P62二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；TUNEL試劑盒、Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（羅氏公司）；DAPI染料、Trizol（Invitrogen公司）；PCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 心衰模型的制作及動物分組 取雄性Wistar大鼠，依照傳統方法［5］建立由心肌梗死（MI）誘發的大鼠心衰模型，術后24 h超聲評價左室射血分數（LVEF）小于0.50即MI模型制備成功，4周后超聲檢查LVEF小于0.35即心衰造模成功。簡單隨機抽樣法從中抽取20只分為模型組（M組）、曲美他嗪組（Q組），每組各10只。另設假手術組（S組）10只，除未結扎冠狀動脈外，余步驟與M組相同。Q組給予曲美他嗪15 mg·kg-1·d-1灌胃4周，其余2組給予等量生理鹽水灌胃4周。

1.2.2 左室超聲評價左心室功能 大鼠用異氟烷麻醉成功后，用Vevo2100小動物超聲儀于胸骨旁左室長軸和短軸采集左心室圖像，并在二維引導下獲得M型超聲心動圖，測量LVEF、左室短軸縮短率（FS）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期內徑（LVEDD）以及收縮末期左室后壁厚度（LPWS）、舒張末期左室后壁厚度（LPWD）。

1.2.3 有創血液動力學測定評價左心室功能 大鼠用5%水合氯醛按6 mL/kg腹腔注射麻醉后，于右側頸總動脈用PE10導管向近心端緩慢插入左心室，通過PV-Loop壓力-容積系統記錄大鼠心輸出量（CO）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張壓（LVDP）、左室舒張末壓（LVEDP）、等容收縮期左室內壓最大上升速率（+dp/dtmax）以及等容舒張期左室內壓最大下降速率（-dp/dtmax）。

1.2.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清N-末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）和超敏肌鈣蛋白T（hs-TnT）水平 血液動力學測定結束后，在大鼠腹主動脈處取血，獲取血清標本，按ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清NT-proBNP和hs-TnT水平。

1.2.5 HE染色和Masson染色觀察心肌病理學改變 經腹主動脈用磷酸鹽緩沖液（PBS）灌流，留取心臟組織，部分用于制備石蠟切片，行HE染色和Masson染色，觀察心肌組織細胞結構及膠原纖維的變化。

1.2.6 TUNEL染色觀察心肌凋亡情況 應用石蠟切片進行TUNEL熒光染色，實驗步驟參照試劑盒說明書。染色后應用DAPI進行細胞核復染，觀察心肌細胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot法測定LC3B、P62的蛋白表達 剪取大鼠部分心肌組織包裹于錫箔紙中，液氮速凍30 min后，放入-80℃冰箱保存，后剪取30 mg心肌組織，剪碎，加入組織裂解液，使用細胞破碎儀進行組織破碎。4℃以12 000 r/min離心15 min提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%SDSPAGE電泳分離，上樣30μg/孔，恒壓120 V，3 h轉膜，5%脫脂奶粉封閉 2 h，一抗 LC3B、p62、GAPDH（稀釋濃度均為 1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（稀釋濃度為1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL化學發光顯色，用凝膠成像儀對膠片進行掃描，用VersaDoc凝膠成像分析系統對目標帶的灰度值進行分析，計算LC3及P62與GAPDH灰度值比值即為LC3及P62蛋白的相對表達量。

1.2.8 RT-PCR 檢測 Beclin-1、Atg7、Atg5、Atg14 的 mRNA表達 將超低溫保存的上述組織樣本50 mg采用Trizol一步法提取總RNA，用紫外分光光度計定量，取少量進行RNA含量及純度測定，要求其OD260/OD280值處在1.7～2.0范圍。應用Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉錄得到相應cDNA產物，條件：25℃10 min，48℃30 min，95℃5 min。應用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行PCR反應，各基因上、下游引物見表1。擴增條件：95℃10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。應用 Bio-Rad實時定量PCR儀分析軟件調整閾值后，查看并分析數據，得到每個樣品反應的Ct值，計算得到ΔCt，ΔCt=待測基因Ct值-內參照基因（GAPDH）Ct值，并與對照組比較，取 2-ΔΔCt值進行數據統計。

Tab.1 The sequence of detected gene primers表1 各檢測基因及內參照引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 曲美他嗪對心衰大鼠心臟超聲相關指標的影響 M型超聲心動圖檢測結果顯示，與S組相比，M組 LVEF、FS、LPWD、LPWS 下降，LVEDD、LVESD 增大，差異有統計學意義（P＜0.05），大鼠心室腔擴張，左室室壁運動減弱，心功能下降。經曲美他嗪治療4周后，與 M 組相比，Q 組 LVEF、FS、LPWD、LPWS升高，LVEDD、LVESD降低，差異有統計學意義（P＜0.05），大鼠心室腔擴張及左室室壁運動狀態得到改善，心功能有所提高，見圖1、表2。

2.2 曲美他嗪對心衰大鼠血流動力學的影響 PVLoop左室插管檢測大鼠左室壓力容積變化結果顯示，與 S組相比，M 組 CO、LVSP、LVDP 及±dp/dtmax降低，LVEDP升高，差異有統計學意義（P＜0.05），大鼠心功能降低。與M組相比，Q組CO、LVSP、LVDP及±dp/dtmax升高，LVEDP降低，差異有統計學意義（P＜0.05），大鼠心功能改善，見表3。

Fig.1 M type echocardiography of ventricular wall motion in three groups of rats圖1 各組大鼠室壁運動M型超聲心動圖

Tab.2 Comparison of ultrasound related indexes of left ventricle in rats of each group表2 各組大鼠左室超聲相關指標比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of ultrasound related indexes of left ventricle in rats of each group表2 各組大鼠左室超聲相關指標比較 （n=10，±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與 S 組比較，b與 M 組比較，P＜0.05；表 3～5 同

?

Tab.3 Hemodynamic indexes in three groups of rats表3 各組大鼠血液動力學相關指標 （n=10，±s）

Tab.3 Hemodynamic indexes in three groups of rats表3 各組大鼠血液動力學相關指標 （n=10，±s）

?

2.3 曲美他嗪對心衰大鼠心肌組織的影響 HE染色結果（心臟橫切圖）顯示，與S組相比，M組大鼠左室擴張，左室前壁變薄，梗死區較大；與M組相比，Q組此病理情況得到改善。高倍鏡下，S組心肌細胞大小、結構正常，排列整齊；M組左室梗死區心肌細胞排列紊亂，界限不清，呈現明顯水腫和壞死，且大量炎性細胞浸潤，心肌細胞損傷嚴重；與M組相比，Q組明顯改善，細胞排列略不整齊，略腫脹，部分壞死，有少量炎性細胞浸潤，見圖2。Masson染色結果顯示，與S組相比，M組大鼠左室梗死區存在大片藍色膠原沉積；與M組相比，Q組梗死區藍色膠原沉積明顯減少，曲美他嗪可減少心肌梗死后的膠原沉積，改善左室病理性重構，見圖3。

Fig.2 Results of HE staining in myocardial tissues of three groups of rats圖2 各組大鼠心肌組織HE染色結果

Fig.3 Results of Masson staining in myocardial tissues of three groups of rats(×40)圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色結果（×40）

Fig.4 Results of TUNEL/DAPI staining in myocardial tissues of three groups of rats(TUNEL/DAPI,×50)圖4 各組大鼠心肌組織TUNEL/DAPI染色結果（TUNEL/DAPI，×50）

2.4 曲美他嗪對心力衰竭大鼠NT-proBNP、hs-TnT的影響 ELISA法檢測結果顯示，與S組相比，M組血清NT-proBNP、hs-TnT水平明顯升高，與M相比，Q組NT-proBNP和hs-TnT水平下降，差異有統計學意義（P＜0.05），曲美他嗪可減輕心衰心肌細胞損傷，見表4。

Tab.4 Indexes of NT-proBNP and hs-TnT in three groups of rats表4 各組大鼠NT-proBNP、hs-TnT指標 （ng/L，±s）

Tab.4 Indexes of NT-proBNP and hs-TnT in three groups of rats表4 各組大鼠NT-proBNP、hs-TnT指標 （ng/L，±s）

組別S組M組Q組F n 10 10 10 NT-proBNP 134.88±24.21 357.08±29.79a 235.12±15.49b 130.100＊＊hs-TnT 58.27±19.23 199.71±74.57a 102.53±36.34b 10.830＊＊

2.5 曲美他嗪對心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響 TUNEL/DAPI染色結果顯示，與S組相比，M組中綠色熒光所指示的凋亡小體數量較多，MI后心衰大量心肌細胞凋亡。與M組相比，Q組綠色熒光明顯減少，經曲美他嗪治療后心肌細胞凋亡明顯減少，見圖4。

2.6 曲美他嗪對LC3B、P62蛋白和Beclin-1、Atg7、Atg5、Atg14的mRNA表達的影響 Western blot及RT-PCR檢測結果顯示，與S組相比，M組LC3B蛋白和Beclin-1、Atg5、Atg7及Atg14的mRNA表達水平降低，P62蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與M組相比，Q組LC3B蛋白和Beclin-1、Atg5、Atg7及Atg14的mRNA表達水平升高，P62蛋白的表達水平下降，差異有統計學意義（P＜0.05），曲美他嗪可以抑制心肌梗死后心衰引起的自噬體合成量減少，并且增加自噬流的暢通性，見表5。

Tab.5 Comparison of autophagy related protein and autophagy related gene expressions between three groups表5 各組大鼠自噬相關蛋白及自噬相關基因相對表達水平的比較 （n=10，±s）

Tab.5 Comparison of autophagy related protein and autophagy related gene expressions between three groups表5 各組大鼠自噬相關蛋白及自噬相關基因相對表達水平的比較 （n=10，±s）

組別LC3B P62Beclin-1 S組M組Q組F 3.78±0.38 1.03±0.07a 2.21±0.49b 29.730＊＊1.94±0.22 3.97±0.56a 2.48±0.51b 10.980＊＊1.02±0.06 0.38±0.04a 0.69±0.06b 64.900＊＊組別S組M組Q組F Atg5 0.95±0.07 0.54±0.07a 0.70±0.03b 24.220＊＊Atg7 1.09±0.10 0.40±0.12a 0.77±0.08b 21.760＊＊Atg14 0.90±0.04 0.53±0.04a 0.62±0.04b 49.570＊＊

3 討論

心力衰竭是多種病因引起心肌損害的最終結果，隨著發病率增加，雖然出現了干細胞移植、左室輔助裝置（LVAD）等新的治療方法，其死亡率仍逐年增加［6-7］，是否有除神經內分泌、細胞因子外的其他機制參與其發生發展成為當前研究的新方向［8］。在心衰心肌細胞內發現自噬后，對其研究成為熱點，但自噬是作為一種保護性機制抑或損傷性機制尚不明確。Lu等［9］在阿霉素誘導的心衰大鼠中，應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤后，發現大鼠Beclin-1表達降低，伴隨心肺血流動力學改善，線粒體膜通透性降低，Na+-K+-ATP酶活性增高，推測自噬在阿霉素誘導的心力衰竭中發揮致病作用，可能通過損傷線粒體實現。Kassiotis等［10］檢測了待移植擴張型心肌病患者植入LVAD后心功能及自噬相關基因、相關蛋白的表達水平，發現植入LVAD后自噬水平下降，心功能改善，推測自噬為心力衰竭的適應性機制，植入LVAD后可減弱該現象。上述兩項實驗僅研究阿霉素誘導的心力衰竭及擴張型心肌病的心功能與自噬水平之間的關系，未涉及心肌梗死后心衰自噬水平的變化、曲美他嗪干預實驗及對心肌組織病理方面的研究。本研究通過觀察梗死后心衰及應用曲美他嗪后心肌自噬水平及心功能、病理等指標變化，探討自噬對心肌細胞的作用及曲美他嗪對心肌自噬水平的影響。

本研究結果顯示，大鼠心肌梗死后心功能惡化、間質纖維化加重、心肌細胞大量凋亡、損傷加重、炎性細胞浸潤并伴隨自噬水平下降、自噬流被阻斷；應用曲美他嗪后，自噬水平升高、自噬流恢復暢通，伴隨心肌細胞凋亡減少，損傷減輕，炎性細胞浸潤減少，間質纖維化減弱，心功能改善，提示自噬對心肌細胞有保護作用，可能與其抑制心肌細胞凋亡及間質纖維化、減輕心肌細胞損傷、減少炎性細胞浸潤，進而抑制心肌重構有關；應用曲美他嗪后，心功能改善，與其上調自噬水平，增加自噬流暢通有關。

本研究為心衰的治療提供了新思路，但由于樣本量較小，僅限于動物研究，未對自噬改善心功能的機制進行基因水平的分析，有待進一步深入探討。

［1］WRITING COMMITTEE MEMBERS，Yancy CW，Jessup M，et al.2016 ACC/AHA/HFSA Focused update on new pharmacological therapy for heart failure：An updateof the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure：A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical practice Guidelines and the Heart Failure Society of America［J］.Circulation，2016，134（13）：e282-e293.doi：10.1161/CIR.0000000000000435.

［2］Orogo AM，Gustafsson AB.Therapeutic targeting of autophagy：potentialandconcernsintreatingcardiovasculardisease［J］.CircRes，2015，116（3）：489-503.doi：10.1161/CIRCRESAHA.116.303791.

［3］Delbridge LMD，Mellor KM，Taylor DJ，et al.Myocardial stress and autophagy：mechanisms and potential therapies［J］.Nat Rev Cardiol，2017，14（7）：412-425.doi：10.1038/nrcardio.2017.35.

［4］McCarthy CP，Mullins KV，Kerins DM.The role of trimetazidine in cardiovascular disease：beyond an anti-anginal agent［J］.Eur Heart J Cardiovasc Pharmacother，2016，2（4）：266-272.doi：10.1093/ehjcvp/pw051.

［5］Xu K，George I，Klotz S，et al.Erythropoietin derivate improves left ventricular systolic performance and attenuates left ventricular remodeling in rats with myocardial infarct-induced heart failure［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2010，56（5）：506-512.doi：10.1097/FJC.0b013e3181f4f05a.

［6］Fisher SA，Doree C，Mathur A，et al.Meta-analysis of cell therapy trials for patients with heart failure［J］.Circ Res，2015，116（8）：1361-1377.doi：10.1161/CIRCRESAHA.116.304386.

［7］Vernooy K，van Deursen CJ，Strik M，et al.Strategies to improve cardiac resynchronization therapy［J］.Nat Rev Cardiol，2014，11（8）：481-493.doi：10.1038/nrcardio.2014.67.

［8］Dick SA，Epelman S.Chronic heart failure and inflammation：what do we really know?［J］.Circ Res，2016，119（1）：159-176.doi：10.1161/CIRCRESAHA.116.308030.

［9］Lu L，Wu W，Yan J，et al.Adriamycin-induced autophagic cardiomyocyte death plays a pathogenicrole in a rat model of heart failure［J］.Int J Cardiol，2009，134（1）：82-90.doi：10.1016/j.ijcard.2008.01.043.

［10］Kassiotis C，BallalK，Wellnitz K，et al.Markers of autophagy are downregulated in failing human heart［J］.Circulation，2009，120（11）：191-197.doi：10.1161/CIRCULATIONAHA.108.842252.