干擾SET8抑制血管平滑肌細胞轉分化的研究

張東雪，高少輝，李同妙，周薇

血管鈣化是導致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）發病率與死亡率升高的關鍵環節和獨立危險因素［1］。血管鈣化不是一個被動的過程，而是由細胞介導的高度可調的過程［2］，其重要機制是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的成骨樣表型轉化。賴氨酸甲基轉移酶SET8是現今發現唯一能夠特異性單甲基化組蛋白H4賴氨酸第 20位賴氨酸（histone H4 lysine 20，H4K20）的甲基轉移酶，參與調控細胞增殖、凋亡、細胞轉移與分化等［3］。SET8 還可甲基化 TWIST、Wnt、P53等非組蛋白［4］，并通過調節轉錄過程影響相應基因的表達，進而調節細胞的轉移與分化等。也有研究表明活化的Wnt信號通路可通過上調RUNX2的表達進而促進血管鈣化［5］。但SET8在VSMCs轉分化中的作用尚少見相關研究。為此，本研究以大鼠VSMCs為模型，觀察SET8對大鼠VSMCs向成骨樣細胞分化的影響。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各目的基因引物序列

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由河北醫科大學動物實驗中心提供的清潔級健康雄性SD大鼠8只（合格證編號：1305090），均為4周齡，體質量 80～120 g，平均體質量（95.7±6.5）g。

1.2 實驗試劑及儀器 胎牛血清（fetal bovineserum，FBS）和DMEM（dulbecco’s modified eagle’s medium）培養基由美國GIBCO公司提供，SET8-短發夾RNA（shRNA）質粒及空質粒（NS-shRNA，廣州復能基因有限公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），堿性磷酸酶（ALP）活性試劑盒（中國Njjcbio公司），反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（美國Thermo公司），PCR引物（上海捷瑞生物工程有限公司），RUNX2抗體和SET8抗體（英國Abcam公司），GAPDH抗體（美國Bioworld公司）。細胞培養箱（美國Sheldon公司），RT-PCR儀（美國Abi公司），倒置相差熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），酶標儀（美國Biotek公司），凝膠成像系統（美國Proteinsimple公司），蛋白電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.3 實驗模型的制備與分組 采用組織塊貼壁法培養原代大鼠胸主動脈VSMCs，具體操作為：采用2%戊巴比妥鈉進行麻醉，75%乙醇浸泡，于生物安全柜中分離出胸主動脈，剝除內外膜，將中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，均勻鋪滿瓶底，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，48 h后更換新鮮培養基。之后每隔2 d換液，細胞融合80%～90%時進行傳代。細胞傳代培養至第3～4代時用于細胞實驗。將細胞接種于適宜孔板中，融合率達80%時給予轉染干預。轉染方法為：參照脂質體LipofectamineTM2000說明書進行轉染，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞內綠色熒光蛋白表達。實驗分組為：（1）正常對照組：未轉染組。（2）空質粒組：NS-shRNA質粒濃度為2μg/L、Lipo2000 為 4 μL/孔，轉染 VSMCs。（3）SET8-shRNA 組：SET8-shRNA 質粒濃度為 2μg/L、Lipo2000為 4μL/孔，轉染VSMCs。

1.4 RT-PCR測定VSMCs內SET8、RUNX2 mRNA的表達水平 采用RNA提取試劑提取轉染后3組的mRNA并逆轉錄為cDNA。測定各組SET8與RUNX2的mRNA表達。實驗重復3次。以各組cDNA為模板，GAPDH作為內參照。PCR引物由Primer 5.0軟件設計，見表1。反應條件：GAPDH條件為95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環28次，繼續72℃延伸10 min。RUNX2條件為95℃變性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 40 s，循環 30次，繼續72℃延伸10 min。SET8條件為95℃變性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸40 s，循環38次，繼續72℃延伸10 min。產物經質量濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳后，采集圖像進行分析。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測VSMCs內SET8、RUNX2蛋白的表達 采用蛋白提取試劑提取轉染后3組的細胞總蛋白。應用BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性后按每

孔總蛋白50μg加樣，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，電泳條件為95 V電泳1.5 h。之后用干轉儀進行轉膜，轉膜時間為0.5 h。后放入5%的脫脂奶粉中于37℃恒溫箱中封閉2 h。一抗4℃孵育過夜，一抗稀釋比例分別為（GAPDH 1∶10 000，RUNX2 1∶500，SET8 1∶500）。次日洗膜，放入鼠二抗中（二抗稀釋比例為1∶10 000），室溫搖床孵育1 h，ECL顯色并應用凝膠成像系統采集圖像進行分析。實驗重復3次。

1.6 ALP活性測定 細胞轉染干預7 d后棄上清液，用PBS緩沖液洗2次，加適量質量濃度1%的TritonX?100溶液，4℃冰箱靜置24 h，反復吹打細胞使其充分裂解，離心后棄沉淀物取上清液，按照ALP活性試劑盒說明書進行操作，應用酶聯免疫吸附法于酶標儀520 nm波長處測定ALP的吸光度值，同時提取胞質蛋白，應用BCA法測定蛋白質的含量，用以校正ALP的活性（U/mg）。實驗均重復3次。

1.7 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SET8-shRNA對VSMCs SET8 mRNA和蛋白表達的影響 SET8-shRNA轉染VSMCs 48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉染效率為50%。RT-PCR和Western blot結果顯示，SET8-shRNA組VSMCs細胞中SET8 mRNA和蛋白的表達水平均低于正常對照組和空質粒組（均P＜0.05），正常對照組與空質粒組比較差異無統計學意義，見圖1。

2.2 SET8-shRNA對VSMCs RUNX2 mRNA和蛋白表達的影響 RT-PCR和Western blot結果顯示，SET8-shRNA組RUNX2 mRNA和蛋白的相對表達量均低于正常對照組和空質粒組（均P＜0.05），正常對照組與空質粒組比較差異無統計學意義，見圖2。

2.3 SET8-shRNA對VSMCs ALP活性的影響 與正常對照組和空質粒組比較，SET8-shRNA組ALP活性顯著降低（均P＜0.05），正常對照組與空質粒組比較差異無統計學意義，見圖3。

Fig.1 The influence of SET8-shRNA on VSMCs of SET8 expression圖1 SET8-shRNA對VSMCs SET8表達的影響

Fig.2 The influence of SET8-shRNA of RUNX2expression on the VSMCs圖2SET8-shRNA對VSMCs RUNX2表達的影響

Fig.3 The changes of alkaline phosphatase activity in VSMCs圖3 VSMCs各組ALP活性的變化

3 討論

血管鈣化在心血管疾病患者中普遍存在，主要表現在中膜鈣化，且與心血管事件的發生密切相關，而VSMCs是血管中膜的主要組成成分，是血管中膜發生鈣化的結構基礎［6-7］。VSMCs向成骨樣轉化是血管鈣化的重要機制之一［8］。Quarles［2］研究發現，中膜鈣化是一個主動的、受細胞和基因調控的、似成骨形成的過程，其特性為成骨樣分化。因此，抑制VSMCs的轉分化是減少血管鈣化的關鍵。SET8在腫瘤中發現具有促進上皮細胞間充質轉分化的作用［9］。鑒于此，本研究通過干擾大鼠VSMCs SET8的基因表達，發現SET8可明顯抑制大鼠VSMCs RUNX2 mRNA和蛋白的表達，提示SET8可能參與了大鼠VSMCs向成骨樣細胞轉分化的過程。

Linscott等［10］研究發現 SET8 能夠特異性單甲基化組蛋白H4K20，能招募特異的調節蛋白，在細胞內具有調控組蛋白修飾、調節染色質結構和基因轉錄、調控細胞周期等作用，其主要參與細胞增殖、細胞轉移分化等多種細胞生理功能。RUNX2是轉錄因子runt家族成員之一，是調控間充質干細胞向成骨、軟骨轉化所必需的核心轉錄因子，在細胞的表型轉化中發揮重要作用［11］。有研究表明SET8作為共刺激因子參與了Wnt調控靶蛋白RUNX2表達的作用，進而調節VSMCs的表型轉化［12-14］。為了證實SET8是否與VSMCs的表型轉化直接相關，本研究通過對 VSMCs進行轉染空質粒（NS-shRNA）和SET8-shRNA質粒，結果顯示正常對照組與空質粒組比較RUNX2表達水平無明顯變化，說明VSMCs轉染質粒對RUNX2表達無明顯影響。而SET8-shRNA組RUNX2表達水平均顯著低于正常對照組和空質粒組，提示干擾SET8基因表達可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細胞表型轉化。ALP活性與成骨細胞的活性及成骨作用有關，也是VSMCs表型轉化的早期指標［15］。本研究結果顯示，與正常對照組和空質粒組比較，SET8-shRNA組ALP活性顯著降低，正常對照組與空質粒組無明顯差異，進一步提示干擾SET8基因表達可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細胞表型轉化。

綜上所述，SET8-shRNA可有效抑制VSMCs中SET8的表達。干擾SET8基因表達可有效降低大鼠VSMCs RUNX2表達水平以及ALP活性，進而抑制其表型轉化。本研究僅在細胞實驗中發現了干擾SET8可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細胞表型轉化的現象，其影響VSMCs表型轉化的具體機制仍需進一步研究驗證。

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