桑葉粉中鈣的含量測定及生物利用

李佳瑋,張宇聰,張素葵,黃 艷,鐘 耕,2,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.西南大學國家級本科實驗教學示范中心,重慶 400716)

桑葉(MorusalbaL),又名鐵扇子、神仙葉等,主要分布在亞熱帶、北溫帶、非洲熱帶和美洲等地區,我國有近千萬畝桑園,其中在四川、廣西及長江中下游地區分布較廣[1]。研究表明,桑葉富含多種功能性成分,例如糖類、脂肪、氨基酸、膽堿、有機酸、黃酮類化合物、植物甾醇、礦物質、維生素等[2-3],具有降血糖、降血壓、降低膽固醇、抗衰老、增強免疫力等功效[4-5]。近年來,各國學者都在致力于開發天然、安全的保健食品,桑葉因其資源豐富,便宜易得,并具有多重保健功能而受到廣泛關注。據報道,桑葉中鈣含量可高達2699 mg/100 g[6],遠高于牛奶(110 mg/100 g)、豆制品(230 mg/100 g)、奶酪(410 mg/100 g)等食品[7],但未見其補鈣和增強骨密度功效等研究報道。

鈣對機體健康十分重要,增加膳食鈣的攝入量可降低骨質疏松、高血壓、癌癥等疾病發生的機率[8]。研究表明,人體中回腸是鈣吸收的主要部位,其吸收量超過機體所吸收鈣總量的80%,結腸也有少量鈣的吸收[9]。1986年Harvey提出新的鈣吸收理論,認為Ca2+先在腸道內與氨基酸或短鏈多肽結合,然后再以整體的分子狀態被吸收[10],目前該理論已被大量的實驗證明。Miller[11]等發明了簡單快速的體外評價方法,并發現體內外評價具有很好的相關性,因此常用于評價不同鈣源鈣的生物利用性,通常測定指標為在模擬胃腸道環境中鈣的溶解度和透析度[12]。

本文對產自四川大竹縣的桑葉粉中總鈣含量及不同形態鈣含量進行測定,同時,體外模擬胃/腸消化體系,比較了桑葉粉、碳酸鈣、葡萄糖酸鈣三種鈣源在模擬胃腸道消化環境中鈣的溶解度和透析量,從而達到對桑葉粉中鈣生物利用性的體外初步評估,為進一步開發以桑葉粉為主要原料的天然補鈣制品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉粉 由四川今日農業開發有限公司提供;硝酸 優級純,成都市科龍化工試劑廠;鹽酸 優級純,重慶川東化工;硫酸 分析純,重慶川東化工;醋酸、乙醇、乙醚 分析純,成都市科龍化工試劑廠;碳酸鈣、葡萄糖酸鈣 優級純,天津市光復精細化工研究所;胃蛋白酶 2500 U/mg蛋白 1∶2500,Sigma Chemicals,USA;胰蛋白酶 250 U/mg胰蛋白 1∶250,Amresco,USA。

高速臺式離心機5810 德國Eppendorf公司;原子吸收分光光度計TAS-990 北京普析通用儀器有限公司;脂肪測定儀SZF-06A 上海新嘉電子有限公司;凱氏定氮儀KT260 丹麥福斯;馬弗爐SX-4-10 天津市泰斯特儀器有限公司;全自動氨基酸分析儀L-8800 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葉粉中基本成分含量測定 水分含量測定:采用直接干燥法,參照GB 5009.3-2010進行。灰分的測定:采用灼燒法,參照GB 5009.4-2010進行。蛋白質:采用凱氏定氮法,參照GB 5009.5-2010進行。粗脂肪:采用索氏抽提法,參照GB/T 5009.6-2003進行。粗纖維:參照GB/T 5009.10-2003進行檢測。

1.2.2 桑葉粉中總鈣含量測定 稱取1.00 g左右桑葉粉于150 mL三角瓶中,加入20.0 mL HNO3-HClO4(4∶1)混合酸,三角瓶口放小漏斗,在電爐上加熱消化,直至無色透明為止,加入2.0 mL超純水用于除去多余的硝酸,待三角瓶中所剩液體約為2～3 mL時停止加熱,冷卻后,將樣品轉移到50 mL容量瓶中,用20 g/L的氧化鑭多次清洗三角瓶,合并洗液,用20 g/L氧化鑭定容,搖勻,待測。試樣做3個重復,同時取與消化樣品所用等量的混酸,按照相同的操作方法做空白實驗。標準曲線繪制方法及測定參數參見GB/T 5009.92-2003[13]。

1.2.3 桑葉粉中不同形態鈣含量測定 參照Ohat等[14]的方法進行提取,具體提取順序、提取劑及對應鈣的形態見表1。具體操作步驟:稱取桑葉粉(0.500±0.005) g于50 mL離心管中,于37 ℃恒溫振蕩器上用不同溶劑10 mL依次提取1 h,4000 r/min離心10 min,將上清液移至25 mL容量瓶中,用5%鹽酸定容[15],最后剩余的殘渣用蒸餾水沖洗后烘干,混和酸消化,浸提液和消化液采用原子吸收分光光度計測定鈣含量。

表1 不同形態鈣提取順序及所用試劑[8]Table 1 Extraction procedure and reagents of calcium from mulberry leaf powder[8]

1.2.4 桑葉粉中氨基酸組成分析 準確稱取100.00 mg桑葉粉于水解管中,在水解管中加入10 mL鹽酸(6 mol/L),加入蒸餾的苯酚3～4滴,再將水解管放入冷凍劑中,冷凍3～5 min,用真空泵抽真空(接近0 Pa),充入高純氮氣,重復抽真空充氮氣三次,在充氮氣狀態下封口,將已封口的水解管放在110 ℃恒溫干燥箱內水解22 h,取出冷卻至室溫。打開水解管,將水解液過濾,用去離子水對水解管進行多次沖洗,將水解液全部移到50 mL容量瓶中并用去離子水定容。吸取濾液1 mL于5 mL容量瓶中,真空干燥器40～50 ℃干燥,殘留物用1～2 mL水溶解,干燥,反復進行兩次,最后蒸干,用1 mL pH2.2的緩沖液溶解,待上機測定[16-18]。

1.2.5 模擬胃部及腸道消化 人工胃蛋白酶液:準確稱取1.00 g NaCl、1.60 g胃蛋白酶于500 mL燒杯中,加入400 mL純水,攪拌至完全溶解,再加入3.5 mL濃鹽酸。純水稀釋至近500 mL,調節pH至1.5,純水定容,現配現用。

人工模擬腸液:稱取0.68 g KH2PO4,加入25 mL蒸餾水使其溶解,加入7.7 mL 0.2 mol/L NaOH和50 mL純水,混勻,加入1.00 g胰蛋白酶和6.00 g豬膽鹽,攪拌至完全溶解,用0.2 mol/L的NaOH調節pH至7.6,現配現用。

人工模擬腸液(不含胰蛋白酶):稱取0.68 g KH2PO4,加入25 mL蒸餾水使其溶解,加入7.7 mL 0.2 mol/L NaOH和50 mL蒸餾水,混勻,調節pH至7.6[19]。

透析袋(10KD)的處理:將透析袋剪斷成12 cm左右,堿性EDTA溶液煮沸30 min,純水反復沖洗以除去EDTA,于蒸餾水中4 ℃保存待用,接觸透析袋時需戴手套。

體外模擬胃部消化方法:將25 mL pH=1.5的HCl溶液加入到50 mL離心管中,在37 ℃水浴鍋中預熱5 min,再各加入0.25 g碳酸鈣、葡萄糖酸鈣及桑葉粉和0.16 g/mL胃蛋白酶液0.5 mL,旋緊蓋子,在37 ℃恒溫振蕩器中,恒速150 r/min模擬消化,n min(n分別為5、10、20、30、60、120)后取出置于沸水中滅酶5 min,冷卻后用冷凍離心機8000 r/min離心10 min,取適量上清液經混和酸消化,原子吸收分光光度計測鈣含量[20]。

式中:S:樣品中可溶性鈣含量(mg),C:樣品中總鈣含量(mg)。

體外模擬腸道消化方法:將25 mL pH=1.5的HCl溶液加入到50 mL離心管中,在37 ℃水浴鍋中預熱5 min,再加入0.25 g碳酸鈣、葡萄糖酸鈣及桑葉粉和0.16 g/mL胃蛋白酶液0.5 mL,在37 ℃恒溫振蕩器中,恒速150 r/min模擬消化2 h。取出樣品用0.2 mol/L NaOH溶液調節pH為7.6,加入2.5 mL模擬腸液,裝入透析袋(10KD)內,透析袋置于玻璃瓶中,向玻璃瓶中加入100 mL人工腸液,在37 ℃恒溫振蕩器中,恒速150 r/min模擬消化,n h(n分別為0.5、1、2、4、6、8)時移取1 mL透析液,經混和酸消化后測定鈣含量,同時添加1 mL不含酶消化液[19]。

式中:D:透析液中鈣含量(mg);C:樣品中總鈣含量(mg)。

2 結果與分析

2.1 桑葉粉中基本成分測定結果

桑葉粉基本成分含量測定結果如表2所示。由表可知,桑葉粉蛋白質含量豐富,近年來的研究表明,當機體攝入蛋白質水平升高時,機體對鈣的吸收會顯著增加,這可能是因為增加蛋白質或氨基酸的攝入量會增加Ca2+結合配體所致[21]。粗脂肪含量為6.62%。桑葉的其他成分中剩余部分為碳水化合物、淀粉等多糖,因不屬于本實驗討論范圍,故而沒有列出。

表2 桑葉粉中基本成分含量表Table 2 The basic composition of mulberry

2.2 桑葉粉中總鈣及不同形態鈣含量

鈣標準曲線見圖1。

圖1 鈣標準曲線Fig.1 Standard curve of calcium

桑葉粉總鈣及不同形態含量如表3所示。由表可知,所選桑葉粉中鈣含量豐富,達到1614.85 mg/100 g,高于牛奶(110 mg/100 g)、豆制品(230 mg/100 g)、奶酪(410 mg/100 g)等食品[7]。對于人體而言,可以吸收的鈣為水溶性鈣、果膠鈣及碳酸鈣,桑葉粉中這3種鈣的比例接近總鈣含量的60%。因此,桑葉粉不僅鈣含量高,而且其中鈣的存在形態有利于人體的消化吸收。

表3 桑葉粉中不同形態鈣含量Table 3 The content of calcium in different forms of

2.3 桑葉粉中氨基酸組成分析

桑葉粉氨基酸組成分析結果如表4所示。由表可知,桑葉粉氨基酸含量豐富,其中含量最高的是谷氨酸,占氨基酸總量的13.27%。谷氨酸在維護腦組織功能、糖代謝及蛋白質代謝中具有重要地位,而且是γ-氨基丁酸(GABA)的前體物質[6],賴氨酸占氨基酸總量的7.38%。同時,桑葉粉含有賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸這7種人體必需氨基酸,占總氨基酸的40.79%,比例接近雞肉、草魚、豬肉[22]等,易于被人體吸收利用。必需氨基酸與非氨基酸含量的比值為68.88%,與WHO/FAO規定的EAA/TAA=40%,EAA/NEAA=60%接近,表明桑葉中的蛋白質比例與理想蛋白質標準較接近[23-24]。

圖2 桑葉粉氨基酸組成分析圖譜Fig.2 Analytical pattern of the amino acid composition of mulberry leaf powder

表4 桑葉粉中氨基酸組成分析Table 4 Amino acid composition of mulberry leaf powder

2.4 桑葉粉中鈣的生物利用

2.4.1 模擬胃部消化 碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、桑葉粉在模擬胃部消化環境中鈣的溶解度隨時間變化情況如圖3所示。由圖可知,碳酸鈣和葡萄糖酸鈣在胃酸的作用下快速釋放出大量鈣離子,消化5 min時鈣的溶解度分別達到79.51%和68.13%;隨著消化時間的延長,鈣離子繼續溶出,但速率有所放緩,當消化時間為1 h時溶解度分別達到97.66%和89.71%;1 h后鈣離子的釋放速率逐漸趨于平穩。這與劉鳳茹[25]的研究結果一致。總體而言,桑葉粉鈣離子釋放速率較碳酸鈣和葡萄糖酸鈣更為緩慢。胃部消化結束時,鈣的溶解度關系為碳酸鈣>葡萄糖酸鈣>桑葉粉,這可能與桑葉粉中鈣的結合態有關,而不同結合態鈣在胃中的溶解度及與時間的關系,值得進一步深入研究。碳酸鈣、葡萄糖酸鈣及桑葉粉在胃部消化中對于鈣的溶解度的p值為0.005(<0.01),因此具有極顯著的差異。

圖3 模擬胃部消化鈣的溶解度隨消化時間變化情況Fig.3 Effects of digestion times on the solubility of calcium in simulated gastric fluid

碳酸鈣在胃中的快速釋放與自身易溶于酸的性質有關,胃部屬于強酸性環境,且實驗所用的碳酸鈣呈粉末狀,與酸充分接觸,所以短時間內快速釋放出大量鈣離子。碳酸鈣因其含鈣量高,價格便宜而被廣泛用作補鈣劑原料,但碳酸鈣不溶于水,人體攝入后必須由胃酸作用解離出鈣離子后才能被小腸吸收,對胃酸的依賴性強,對于胃酸分泌不足的人而言,攝入碳酸鈣吸收率低,不能達到補鈣的目的。在胃中釋放出的大量鈣離子易與胃中胃酸結合形成氯化鈣;鈣離子進入小腸后與小腸中的次碳酸作用形成不溶性的鈣鹽如磷酸鈣,由糞便排出,所以胃部大量釋放鈣離子將會使得腸道可吸收的鈣相對減少[26]。

模擬胃部消化結果表明,桑葉粉能在胃酸的作用下釋放出鈣離子,相較于碳酸鈣和葡萄糖酸鈣的快速釋放能減輕對胃的刺激。理論角度分析,在與碳酸鈣和葡萄糖酸鈣中總鈣量相當時,桑葉粉由于在胃部釋放出較少的鈣離子,使得腸道可吸收的鈣量相對增多。

2.4.2 模擬腸道消化 腸道是人體鈣吸收的主要部位,實驗中模擬腸道環境(包括胰蛋白酶、豬膽鹽),并用透析袋模擬腸壁,測定不同消化時間點透析液中鈣的濃度從而計算鈣的透過率。

碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、桑葉粉在模擬小腸消化環境中鈣的透過率隨時間變化情況如圖4所示。由圖可知,隨消化時間的延長,3種鈣源鈣的透過率都呈上升趨勢,消化結束時鈣的透過率關系為桑葉粉>葡萄糖酸鈣>碳酸鈣。碳酸鈣、葡萄糖酸鈣及桑葉粉在腸道消化中對于鈣的透過率的p值為0.042(p<0.05),因此之間具有顯著的差異性。

圖4 模擬腸道消化鈣的透過率隨消化時間變化情況Fig.4 Effects of digestion times on the dialysis of calcium in simulated intestinal fluid

腸道屬于堿性環境,碳酸鈣在前期胃部消化時游離出的大量鈣離子在堿性環境下生成氫氧化鈣沉淀,且碳酸鈣不溶于水,因此鈣的透過率一直較低,消化結束后僅達到34.05%;葡萄糖酸鈣微溶于水,且在胃部消化結束后部分鈣未溶出,所以鈣的透過率高于碳酸鈣。桑葉粉中鈣的透過率在前4 h低于葡萄糖酸鈣,4 h后高于葡萄糖酸鈣,可能是因為桑葉粉在模擬胃部消化時鈣的溶解度低于葡萄糖酸鈣,膜內外滲透壓更低,因此擴散運動速率慢,所以透析液中鈣含量少;隨著消化時間的延長桑葉粉中一些大分子物質在胰蛋白酶的作用下被分解為小分子,進而釋放出更多的鈣離子,膜內外滲透壓升高,擴散速率加快;或者鈣離子與賴氨酸、精氨酸等形成可溶性的鈣鹽,一方面避免了在堿性環境中形成氫氧化鈣沉淀,另一方面一些小分子鈣鹽可以直接通過透析袋,所以鈣的透過率增大[27]。而葡萄糖酸鈣在堿性環境中鈣離子不斷與氫氧根離子形成沉淀,在腸道內的溶解度逐漸降低,鈣的透過率逐漸低于桑葉粉。

3 結論

本文對產自四川大竹的桑葉粉基本成分、總鈣及不同形態鈣含量進行測定,同時分析其氨基酸組成,體外模擬胃腸道消化體系對其生物利用度進行評價,得出以下結論:

桑葉粉中鈣含量為1614.85 mg/100 g,相較于常見食品其鈣含量更為豐富。人體可吸收的水溶性鈣、果膠鈣及碳酸鈣在桑葉粉中的比例接近總鈣含量的60%,有利于人體的消化吸收。

桑葉粉中氨基酸含量豐富,含有賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸7種人體必需氨基酸,占總氨基酸的40.79%,該比例接近雞肉、鰱魚、豬肉等,易被人體吸收利用;EAA/NEAA=68.88%,接近FAO/WHO標準模式。

桑葉粉可以在胃酸的酸化作用下緩慢釋放出Ca2+,相對于碳酸鈣和葡萄糖酸鈣的快速釋放,可減輕對胃部的刺激;在模擬腸道中鈣的透過率高于碳酸鈣和葡萄糖酸鈣。

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