非諾貝特對胰島素抵抗大鼠脂肪甘油三酯脂酶表達的影響

祝超瑜 肖元元 葉陽 劉夢丹 曾媛媛 魏麗

[摘要] 目的 觀察非諾貝特對胰島素抵抗大鼠組織中脂肪甘油三酯脂酶（ATGL）表達的影響。 方法 將8周齡雄性SD大鼠隨機分為普食組（NC組，n = 8）及高脂組（HFD組，n = 16），8周后再將HFD組隨機分為高脂對照組（HFD-UT組）及非諾貝特治療組（HFD-FT組）。檢測各組大鼠生化指標，并用胰島素耐量試驗（ITT）、口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）判斷大鼠的胰島敏感性。通過Western blot方法檢測脂肪、肝臟、肌肉組織中ATGL的表達情況。 結果 高脂飲食喂養后大鼠產生胰島素抵抗，脂肪、肝臟、肌肉組織中ATGL蛋白較NC組分別降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01），用非諾貝特治療后，胰島素敏感性增加，同時，脂肪、肝臟、肌肉組織中ATGL的表達較HFD-UT組增加，差異有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。 結論 非諾貝特能促進胰島素抵抗大鼠脂肪、肝臟、肌肉三大代謝組織中ATGL的表達。

[關鍵詞] 高脂飲食；脂肪甘油三酯脂酶；胰島素抵抗；非諾貝特

[中圖分類號] R589.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（a）-0004-05

Effects of Fenofibrate on adipose triglyceride lipase in insulin resistant rats

ZHU Chaoyu XIAO Yuanyuan YE Yang LIU Mengdan ZENG Yuanyuan WEI Li

Department of Endocrinology and Metabolism， the Sixth People's Hospital， Shanghai Jiao Tong University Shanghai Diabetes Institute Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus Shanghai Clinical Center for Diabetes， Shanghai 200233， China

[Abstract] Objective To detect the effects of Fenofibrate on the expression of adipose triglyceride lipase （ATGL） in tissues of insulin resistant rats. Methods Eight-week old male SD rats were randomly divided into normal diet group （NC group， n = 8） and high fat diet group （HFD group， n = 16）. After 8 weeks， the rats in the HFD group were divided into untreated （HFD-UT） group and Fenofibrate treatment （HFD-FT） group. The biochemical indices of all groups were detected， and the insulin sensitivity was detected by oral glucose tolerance （OGTT） and insulin tolerance （ITT）. Western blot was used to assay ATGL protein in epididymal adipose， liver and muscle. Results High fat diet led to insulin resistance， ATGL in adipose tissue， liver and muscle in HFD-UT group were decreased compared with those of NC group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. After Fenofibrate treatment， the insulin sensitivity was improved， and the ATGL levels in adipose tissue， liver and muscle were increased compared with those of HFD-UT group， the differences were statistically significant （P < 0.01 or P < 0.05）. Conclusion Fenofibrate can enhance the ATGL levels in adipose tissue， liver and muscle of insulin resistant rats.

[Key words] High fat diet； Adipose triglyceride lipase； Insulin resistance； Fenofibrate

脂肪甘油三酯脂酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）是三酰甘油（TG）水解的限速酶[1]。ATGL主要在脂肪組織中產生，在肝臟、肌肉等代謝器官中也有表達。TG的異位沉積能破壞胰島素信號的傳導[2]，而作為胰島素作用的靶器官，脂肪、肝臟、肌肉三個組織中TG的代謝顯得尤為重要，探討ATGL在這三大組織中的作用將有助于進一步明確脂代謝異常在胰島素抵抗過程中的作用。基因轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）在脂肪酸氧化代謝活躍的組織中，如脂肪、肝臟、骨骼肌、腎、小腸等，都有表達，主要參與脂肪酸的氧化及能量的消耗。PPARɑ受體激動劑類藥物非諾貝特可改善高甘油三酯血癥及炎性反應[3]，有研究證明其通過降低血脂有改善胰島素敏感性的作用[4]，最新研究顯示其有延緩脂肪肝的作用[5]，但是其對改善組織中TG沉積的作用機制目前尚不清楚。筆者前期研究已經發現胰島素抵抗大鼠ATGL在脂肪、肝臟、肌肉組織中的表達是下降的，為此，我們進一步使用非諾貝特治療胰島素抵抗大鼠，觀察其在改善胰島素抵抗的同時對組織中ATGL表達的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級標準健康8周齡雄性SD大鼠共24只，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（滬）20080016。適應性喂養1周后隨機分為普食組（NC組，n = 8）和高脂組（HFD組，n = 16）。8周后，將HFD組隨機分為高脂對照組（HFD-UT組，n = 8）和非諾貝特治療組（HFD-FT組，n = 8），HFD-FT組給予非諾貝特[雅培，美國，溶于0.9%生理鹽水，100 mg/（kg·d）]灌胃，NC組和HFD-UT組同時予以生理鹽水[10 mL/（kg·d）]灌胃。第9周開始每天下午5：00～6：00進行灌胃，每天1次，共4周。

1.2 實驗材料及試劑

普通飼料，熱量配比：糖類占總熱量的55%，蛋白質占總熱量的21%，脂肪占總熱量的24%，熱量約為3.8 kcal/g。高脂飼料，熱量配比：糖類占總熱量的20%，蛋白質占總熱量的21%，脂肪（以豬油為主）占總熱量的59%，熱量約為5.2 kcal/g。均由中國科學院上海斯萊克實驗動物有限公司提供。

羊抗鼠ATGL單克隆抗體（NOVUS，美國）；兔抗鼠adiponectin單克隆抗體（Cell Signaling，美國）；兔抗鼠β-actin多克隆抗體（Cell Signaling，美國）；兔抗鼠Erk1/2多克隆抗體（Cell Signaling，美國）。

1.3 方法

1.3.1胰島素耐量試驗（ITT）和葡萄糖耐量試驗（OGTT） 喂養12周末每組大鼠分別進行ITT和OGTT。禁食8 h，ITT按0.5 U/kg劑量腹部皮下注射胰島素（優泌林R，美國禮來公司），分別于0、15、30、60、90、120 min尾靜脈取血，以強生血糖儀測定血糖水平；OGTT按2 g/kg劑量予以50%葡萄糖灌胃，分別于0、30、60、90、120 min尾靜脈采血測血糖，酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測OGTT各時點血胰島素水平。

1.3.2 組織TG含量的計算 喂養12周實驗結束后，乙醚麻醉處死大鼠，于5 min內取附睪脂肪、肝組織和肌肉組織，稱重并立即置于液氮中。采用庚烷-異丙醇-吐溫抽提法提取TG，由日立7600 2020自動生化儀測定。

1.3.3 Western blot檢測ATGL蛋白的表達 稱取一定重量的附睪脂肪、肝臟、肌肉組織，提取組織蛋白。取一定量的蛋白進行SDS-PAGE電泳，并用電轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉過夜，分別加入一抗、二抗孵育，最后應用ECL試劑盒顯色反應，X線光片顯影。將顯影結果掃描后，用Image J軟件分別對條帶進行灰度值的測定，并以目的蛋白/內參蛋白的比值計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法

數據處理運用統計分析軟件SPSS 13.0統計軟件包運算。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，檢驗數據正態性，多組間比較用方差分析，組間均數間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體重、體脂比較

HFD-UT組大鼠的體重明顯高于NC組（P < 0.01），HFD-FT組體重較HFD-UT組有減輕，但差異無統計學意義（P > 0.05）。高脂喂養后，HFD-UT組脂肪組織增多，TG含量較NC組明顯升高（P < 0.01）；TG還在肝臟和肌肉沉積，含量均比NC組明顯上升（均P < 0.01）。非諾貝特治療后，HFD-FT組脂肪組織和肌肉TG較HFD-UT組顯著下降（均P < 0.01），肝臟TG也有下降（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠12周后空腹血糖、血脂、肝功能比較

12周治療結束后，HFD-UT組血空腹血糖（FPG）明顯高于NC組（P < 0.01）；HFD-FT組FPG較HFD-UT組有輕微下降，但差異無統計學意義（P > 0.05）。HFD-UT組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平較NC組明顯增高（P < 0.01），HDL-C較NC組明顯下降（P < 0.01），而HFD-FT組大鼠TC、TG、LDL-C均較HFD-UT組明顯下降（P < 0.05），兩組HDL-C水平差異無統計學意義（P > 0.05）；同時，非諾貝特治療后，HFD-FT組ALT較HFD-UT組明顯下降（P < 0.05），但AST無明顯變化（P > 0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠胰島素敏感性的比較

2周后，OGTT實驗結果顯示，與NC組比較，HFD-UT組各時點血糖值均顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）；非諾貝特治療后，HFD-FT組各時點血糖值均較HFD-UT組顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）（圖1A）；同時，HFD-UT組各時點胰島素值均顯著高于NC組（P < 0.05或P < 0.01），HFD-FT組各時點胰島素值均顯著低于HFD-UT組（P < 0.05或P < 0.01）（圖1B）。進一步ITT實驗，HFD組ITT各時點血糖值均顯著高于NC組（P < 0.05或P < 0.01），與HFD-UT組比較，HFD-FT組空腹血糖、各時點血糖值均顯著下降（P < 0.05或P < 0.01），進一步提示大鼠胰島素抵抗模型成功建立，同時非諾貝特治療后有效（圖2）。

A：OGTT試驗中血糖水平；B：OGTT試驗中胰島素水平；與NC組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與HFD-UT組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；OGTT：葡萄糖耐量試驗

2.4 各組大鼠組織中ATGL表達的差異

2.4.1 脂肪組織中ATGL的表達 喂養結束后，取大鼠附睪脂肪組織對ATGL蛋白進行檢測發現，HFD-UT組ATGL較NC組明顯降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；HFD-FT組ATGL表達較HFD-UT組明顯升高（P < 0.05）（圖3）。

2.4.2 肝臟組織中AGTL的表達 對大鼠肝臟組織ATGL進行檢測發現，HFD-UT組ATGL較NC組明顯降低（P < 0.01）；HFD-FT組ATGL表達較HFD-UT組明顯增高（P < 0.05）（圖4）。

2.4.3 肌肉組織中AGTL的表達 對肌肉組織的ATGL檢測結果發現，HFD-UT組ATGL較NC組顯著降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；而HFD-FT組ATGL表達較HFD-UT組顯著上升，差異有高度統計學意義（P < 0.01）（圖5）。

3 討論

高脂飲食使血中TG和游離脂肪酸（FFA）水平增高，增加炎性因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）的表達，致氧化應激，誘發胰島素抵抗[6]，在肝細胞內堆積，引起肝細胞脂肪變性，在肌肉組織沉積，減輕肌肉組織對葡萄糖的攝取[7]，另外增多的游離脂肪酸也可通過抑制胰島素的信號轉導，增加胰島素抵抗[8]。筆者前期研究已經證實了高脂飲食大鼠出現胰島素耐量減低，且糖耐量異常，出現胰島素抵抗[9]。

ATGL的作用是將TG水解為甘油二酯和FFA[10]。小鼠ATGL基因敲除后表現為脂肪增多，出現明顯的肥胖，同時肝臟、肌肉等多個組織均出現了TG的沉積，證明ATGL能促進TG在這些組織中的代謝并加速FFA的氧化[11]。

肝臟和肌肉組織的胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特點[12]。因此，ATGL除了在脂肪組織中有重要作用，在肝臟和肌肉組織中的表達變化也尤為重要。本研究結果發現，高脂飲食誘發大鼠形成胰島素抵抗后，ATGL不僅在脂肪組織表達明顯下降，在肝臟和肌肉組織中的表達也出現下降，該結果與國外研究報道的肥胖人群脂肪組織中ATGL水平表達下降的結果是一致的[13]。

非諾貝特作為PPARα受體激動劑，通過激活PPARα增強脂肪酸的氧化，降低血清中的TG，同時也能抑制TG在肝臟的聚集[14]。在肝臟，PPARα敲除小鼠會出現脂肪酸代謝障礙，進而形成肝臟脂肪沉積，引起肝脂肪變[15]。有研究發現，非諾貝特能通過降低細胞膜內二酰甘油含量增加脂肪酸氧化改善高糖飲食喂養的大鼠的肝臟脂質沉積[16]，也有研究顯示其通過激活高脂飲食喂養的大鼠肝臟AMPK的表達，促進脂肪酸氧化[17]，同時也能恢復胰島素信號傳導通路，進而改善胰島素抵抗，同時起到治療肥胖及血糖異常的作用[18]。在脂肪組織中，非諾貝特能促進內臟脂肪組織氧化，起到縮小脂肪細胞體積并減輕胰島素抵抗的作用[19]。在肌肉組織中，非諾貝特可以通過減輕內質網應激及炎性反應來改善胰島素抵抗[20]。

本研究中非諾貝特在改善高脂飲食大鼠胰島素抵抗的同時，又減輕了肝臟和肌肉中TG的沉積，提示PPARα激動劑可通過消耗脂肪改善包括肝臟、肌肉等部位的脂質沉積，進而增加胰島素敏感性。本研究通過觀察脂肪、肝臟、肌肉組織中ATGL表達的變化發現，非諾貝特治療高脂喂養大鼠后，脂肪組織中ATGL增加的同時，肝臟和肌肉組織中ATGL的表達也出現增高，其中，在脂肪組織中增多較顯著，其次是肌肉，肝臟組織增多不明顯，推測非諾貝特對ATGL的作用程度與各組織中PPARα的表達水平相關。

非諾貝特對ATGL的作用有組織差異性，但是在本研究中，其在脂肪、肝臟、肌肉組織都促進ATGL蛋白的表達。另外，非諾貝特對肝臟和肌肉組織ATGL表達的改變是通過其作用于脂肪組織調控脂質的分布起到間接調節的作用，還是直接作用，目前還不清楚，尚需進一步研究闡明。

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（收稿日期：2017-10-02 本文編輯：張瑜杰）