光周期和紅光對光唇魚卵巢發育和機體氧化應激狀態的影響

，

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2.浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室，浙江 金華 321004)

晝夜交替形成的光周期是自然界中變化最恒定、變動規律最嚴格的信號之一，對動物的季節性繁殖起著重要的調節作用。大部分魚類的繁殖季節與自然界光周期的季節變化間存在明顯的相關性，在進化上，這有利于后代在一年當中最適宜的季節出生以保障幼體的成活率[1]。因此，在實施全人工或反季節繁育過程中，人們可根據魚類在繁殖期對光周期的要求，利用人工照明來調控魚類的繁殖進程[2]。

水下光譜成分會隨水的深度變化而發生顯著改變，如在深水區以穿透能力較強的短波光為主成分，而長波光如紅光則在較淺的水層被吸收[3-4]。但是，短波光在某些渾濁水體中有可能被色素和懸浮顆粒快速吸收與分散，因而導致長波光成為主成分[5-6]。不同波段的光譜可以被魚類視網膜視蛋白及視網膜外的光感受器所感知，生活在不同水域和水層的魚類在長期進化過程中形成了不同的光譜敏感性，如淺水性魚類對長波光的敏感性可能會高于深水性魚類[4，7-8]。此外，魚類的性腺發育和繁殖內分泌對不同波長光照的反應存在物種差異[9-11]。

褪黑素(Melatonin，MT)是一種主要由松果體和視網膜分泌的吲哚雜環類神經內分泌激素組成，其分泌受光的抑制，常表現出白天降低而夜間升高的趨勢[12]。MT可通過下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamus-pituitary-gonad aix，HPG aix)正向或負向調控相關性激素分泌，從而影響魚類的性腺發育[13-15]。MT本身作為一種抗氧化劑，可直接清除自由基，還可調節超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶酶活力[16]，從而降低氧化壓力和減輕卵母細胞損傷與老化，提高卵母細胞質量[17-19]。此外，不同波段的光譜對MT分泌的調節作用存在差異，如紅光等長波光穿透腦部的能力較強，可更有效地調節松果體MT的分泌[20]。

光唇魚(Acrosssoeheilusfasciatus)隸屬鯉形目、鲃亞科、光唇魚屬，主要分布于我國浙江山區溪流內，繁殖高峰期為6—7月[21]，屬典型的長日照繁殖類型。該魚作為一種具有地方特色的溪源性魚類，受到廣大消費者的歡迎。目前光唇魚的人工繁育已基本成功，但在實踐中發現母本存在明顯的性腺發育不同步現象，這成為阻礙規模化繁育的技術瓶頸。為了解決這一問題，并考慮到溪流水淺且透明度高的特點，推測紅光可能對光唇魚的繁殖具有重要影響，因此本研究嘗試以紅光LED作為光源并結合光周期來加速光唇魚母本的性成熟，并分析與生理狀態相關的指標的變化，以期為該魚的全人工繁育或反季節繁育提供理論指導與技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗魚與馴化

2017年5月從浙江省遂昌縣某養殖場購買處于繁殖前期的光唇魚親本，飼養于實驗室全封閉循環水養殖系統中，在12L∶12D光周期和(23±1)℃水溫下馴化2周。期間投喂某品牌全價配合飼料(粗蛋白>40%，粗脂肪>4%)，投喂時間為10∶00和16∶00，日投喂量為體重的2%～3%。循環水養殖系統水質：溶解氧>7.0 mg/L，pH 7.0～7.5，總氨氮<0.5 mg/L，亞硝酸鹽<0.05 mg/L。

1.2 實驗處理

挑選健康、體重均勻的雌性光唇魚64尾[體重(30± 2)g，體長(13 ± 1)cm]，隨機分為4 組(每組2個平行組，8尾/平行組)，各組給予不同的光照條件。光源分別為白色熒光燈管(10 W)和紅光LED燈(632 nm)(圖1)，用定時器控制兩種光周期：12L∶12D和16L∶8D，共設置白光短光照(Short photoperiod with white light，SW)、紅光短光照(Short photoperiod with red light，SR)、白光長光照(Long photoperiod with white light，LW)和紅光長光照(Long photoperiod with red light，LR)4個組。調整燈距水面的高度，使輻照強度達到0.9 W/m2。養殖條件、投喂方式和水質控制同馴化期，實驗周期45 d。

1.3 取樣

養殖實驗結束后，每平行組隨機取4尾魚，經MS-222溶液(800 mg/L)深度麻醉后取樣。分別在12∶00和24∶00尾靜脈取血，血液于抗凝離心管中離心(4℃，3 500 rmp，15 min)，收集血漿用于激素分析。卵巢稱重后鏡檢，肝臟、肌肉組織于-80℃保存備用。

1.4 指標測定

1.4.1 性腺指數測定

魚體和卵巢稱重，精確至0.01 g，根據公式計算性腺指數(Gonadosomatic index，GSI)，公式：GSI = [性腺質量(g)/體質量(g)]×100%。

1.4.2 卵巢組織壓片觀察

取少量卵巢置于載玻片上，滴數滴醋酸洋紅溶液，加蓋玻片并輕輕擠壓，使卵母細胞破裂和分散，移至顯微鏡(Zeiss，Germany)下觀察并拍照，將卵母細胞分為卵原細胞、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期卵母細胞和閉鎖卵泡5個時期[22]，統計各期卵細胞的比例。

1.4.3 血漿褪黑素(MT)含量的測定

利用酶聯免疫檢測(ELISA)試劑盒(IBL，Hamburg，Germany)測定血漿MT含量，試劑盒最低檢測極限為0.5 ng/L，組內和組間變異系數分別小于9%和11%。血漿用量為50 μL，操作步驟參照試劑盒說明書，酶標儀(Pro200，TECAN，Switzerland)于450 nm波長處測定樣品吸光度(OD值)，并根據標準曲線計算樣品濃度。

1.4.4 組織氧化還原狀態評估

將肌肉或肝臟組織剪碎后加入4 倍體積(W/V)預冷的生理鹽水，用組織勻漿機制成勻漿，以3 000 r/min轉速4℃離心5 min，取上清液用于丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量和SOD酶活力測定，步驟參照試劑盒說明書(南京建成生物技術研究所)。組織蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法。MDA含量單位為nmol·mgprot-1，SOD酶活力單位為U·mgprot-1。

1.5 數據分析

用SPSS10.0軟件進行統計分析，數據以平均值±標準誤(Mean ± SE)表示。以光周期和光色作為兩因子，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)比較組間差異，當檢測出各組間有統計差異后，利用Turkey法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 性腺發育

光周期和光色對雌性光唇魚性腺指數(GSI)(A)和不同發育階段卵母細胞相對百分數(B)的影響，結果如圖2所示。紅光長光照組(LR)雌性光唇魚性腺指數(GSI)和Ⅲ期卵母細胞比例最大，而白光短光照組(SW)最小(P<0.05)。在白光下，長光照可顯著增加GSI和提高Ⅱ、Ⅲ 期卵母細胞的比例(P<0.05)，并顯著降低卵原細胞的比例。在紅光下，長光照組(LR)GSI和Ⅲ期卵母細胞比例均顯著高于短光照組(SR)(P<0.05)。在相同光周期下，與白光組(SW或LW)相比，紅光均能顯著誘導GSI和Ⅲ期卵母細胞比例的增加，并降低卵原細胞的比例(P<0.05)。光周期和光色對GSI和Ⅲ期卵母細胞比例的影響具有明顯的交互作用(P<0.05)。

2.2 血漿MT含量

由圖3可知，各組夜間血漿褪黑素(MT)含量普遍高于日間(P<0.05)，紅光長光照組(LR)夜間血漿MT水平最高，而白光短光照組(SW)最低(P<0.05)。在白光下，長光照組(LW)無論日間還是夜間血漿MT水平均顯著高于短光周期組(SW)(P<0.05)。在紅光下，長光照可顯著提高日間或夜間的血漿MT水平(P<0.05)。在兩種光周期條件下，與白光相比，紅光均能顯著提高夜間血漿MT水平(P<0.05)，但對日間MT水平無顯著影響(P>0.05)。光周期與光色對夜間血漿MT水平的影響同樣具有極顯著的交互作用(P<0.01)。

注：SW：白光短光照；SR：紅光短光照；LW：白光長光照；LR：紅光長光照；不同字母表示各組間具有顯著差異(P<0.05)，n=8；下同。

Notes：SW：short photoperiod with white light；SR：short photoperiod with red light；LW：long photoperiod with white light；LR：long photoperiod with red light.Different letters meant significant difference among groups(P<0.05)，n=8；the same as below.

2.3 肌肉和肝臟MDA含量和SOD酶活力

光周期和光色對肌肉組織MDA含量和組織SOD酶活力無顯著影響(P>0.05)(圖4)。紅光長光照組(LR)肝臟MDA含量最高，而白光短光照組(SW)最低(P<0.05)。長光照組(LW和LR)肝臟MDA含量均顯著大于相同光色的短光照組(SW和SR)(P<0.05)。在長光周期下，紅光組(LR)肝臟MDA含量顯著高于白光組(LW)(P<0.05)，但在短光周期下，紅光和白光組(SR和SW)間無統計差異。光周期和光色僅對肝臟MDA含量具有明顯的交互作用(P<0.05)。

3 討論

光周期是調控魚類季節性繁殖最重要的生態因子之一，溫帶魚類大部分屬于長日照繁殖類型，因此利用長光照能夠促進這些魚類的繁殖，相關研究已有大量報道[2，23-24]。野生光唇魚的繁殖主要集中在每年6—7月[21]，此階段自然界光照時間達到峰值，因此其繁殖屬于典型的長日照繁殖類型。本研究中，長光周期(16L∶8D)顯著提高了光唇魚的性腺指數，加速了卵母細胞的發育，這與其繁殖類型相一致。

魚類松果體和視網膜作為光感受器對光譜具有特殊吸收峰，而特定波段的光譜對魚類的繁殖調控存在物種差異。水下光環境與陸地光環境存在巨大的差異，因為部分陽光在輻射時，首先在水面被反射，而通過折射進入水中的光又進一步發生散射，光譜組成和光強度隨著水深的增加而發生明顯的改變[5]，但長波光僅能穿透到較淺的水層[4]。因此，生活在海水或淡水不同水層的魚類可能對不同波長的光譜產生適應性進化。利用電生理技術可以在魚類的松果體中檢測到兩種光色素(視紫紅質和視紫質)，如金魚(Carassiusauratus)松果體光受體的最大吸收峰為530 nm[25]，而虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在500 nm和533 nm處均存在最大吸收峰[26]。魚類視網膜內存在長波、中波、短波、紫外四種視錐色素蛋白，但每種視蛋白的吸收峰存在較大的物種差異。如金魚視錐色素蛋白分別在620、540、440、360 nm處存在最大吸收峰[27-31]，而條紋鱸(Moronesaxatilis)在542 nm和605 nm存在最大吸收峰[32]。Bapary等研究了不同顏色光照對藍刻齒雀鯛(Chrysipteracyanea)卵巢發育的影響，結果表明紅光(627 nm)可顯著增加淺水性魚類的GSI，而且只有在紅光下卵巢中出現了含有卵黃的卵母細胞[9]。類似地，紅光(640 nm)可誘導斑馬魚胚胎數量的增加[11]。本研究中在兩種光周期下紅光(626 nm)均能顯著增加光唇魚的GSI和卵母細胞的成熟度，說明紅光對其性成熟具有明顯的促進作用，與上述研究結果相一致。然而，有研究發現紅光(627 nm)可抑制副金翅雀鯛(Chrysipteraparasema)的性成熟[33]。還有研究表明紅光(630 nm)可抑制金魚神經激素kisspeptin、促性腺激素(Gonadotropin hormones，GTHs)、P450芳香化酶(Cytochrome P450 aromatase，P450 arom)等性成熟相關激素的表達[10]。因此，魚類繁殖對光色的反應存在明顯的物種差異。

在脊椎動物中，褪黑素(MT)主要由松果體和視網膜分泌，其分泌量和晝夜節律受到光周期的調控[34]。光信號可轉化成MT信號將時間信息傳遞至大腦，進而通過HPG軸影響魚類的繁殖。切除松果體顯著抑制了金體美鳊(Notemigonuscrysoleucas)[35]和金魚[36]的性腺發育，卻可促進青鳉(Oryziaslatipes)的性成熟[37]。如MT處理可誘導斑馬魚GSI、排卵量的增加，以及促進繁殖相關基因的表達[38]。飼料內添加MT(50 μg/g)可以顯著促進大馬哈魚(Oncorhynchusketa)性激素的分泌，但添加量提高十倍會起到反作用[13-14]。因此，MT對魚類繁殖的促進作用存在劑量效應，甚至存在負作用。有趣的是，長光照暴露可促進切除松果體和摘除眼球的鯰魚(Heteropneustesfossilis)的性腺發育[39]。目前已有很多報道表明魚類、兩棲類等脊椎動物腦內均檢測到了光受體基因表達，有的還可檢測到MT合成關鍵酶芳烷基胺N-乙酰轉移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase)基因的表達[40-42]，這暗示光信號還可以通過視網膜和松果體外的光感受器影響魚類的繁殖生理，而MT在此過程中充當了重要角色。除光周期外，某些特定波段的光譜對褪黑素分泌具有特殊的調節作用，因此對魚類繁殖的影響也存在差異。如紅光可促進塞內加爾鰨(Soleasenegalensis)[43]和歐洲齒舌鱸(Dicentrarchuslabrax)[44]MT分泌。本研究表明：長光照同時提高了雌性光唇魚日間和夜間的血漿MT水平，尤其以紅光作為光源時夜間血漿MT水平最高，且MT水平越高，其卵巢的成熟度也越高，這暗示長光照和紅光照射可以協同促進該魚的性腺發育，而MT在其中可能扮演了重要的調控角色。

在環境壓力下機體產生的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)會導致細胞膜脂質過氧化(Lipid peroxidation，LPO)，從而影響細胞的存活[45]，而特定波段的光譜可增加或抑制魚體的氧化壓力。如藍光照射有助于提高尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的抗脅迫能力[46]。Shin等研究表明綠光和藍光可以通過提高克氏雙鋸魚(Amphiprionclarkii)體內抗氧化物質的水平，而紅光則可誘導氧化壓力[47]。在本研究中，紅光長光照導致了雌性光唇魚肝臟脂質過氧化物水平的提高，說明紅光對魚體造成了氧化壓力，與上述研究結果較一致。然而，本研究還發現紅光雖然對關鍵抗氧化酶SOD酶活力無顯著影響，但是提高了血液中MT的水平，而MT作為強抗氧化物質，在一定程度上可緩解由紅光引起的氧化壓力。

綜上所述，在循環水養殖條件下以626 nm紅光結合長光周期(16L∶8D)可協同加速雌性光唇魚的性腺發育，從而提高親本繁殖的同步化水平。血漿褪黑素(MT)與性腺指數和卵細胞發育存在一定的相關性，這暗示褪黑素在魚類繁殖調控方面發揮了重要作用。

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