桑葉7種黃酮類成分同時測定及其抑制α-糖苷酶活性的研究*

朱瑞超 ，逯 彬 ，羅 蓉 ，李 晉 ，何 俊 ，王 濤 ，李轉愛 ，常艷旭

（1．天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津 300193；2．天津中醫藥大學中藥學院，天津 300193）

桑葉為桑科植物（Morus alba L.）的干燥葉，具有疏散風熱，清肺潤燥，清肝明目的功效。現代藥理研究表明，桑葉具有明顯的降血糖功效[1]。研究表明桑葉中的降糖活性成分主要有生物堿、多糖、黃酮類成分，其中DNJ（1-脫氧野尻霉素）是其主要降糖活性成分[2-4]，但其中的黃酮類成分也具有較好的降糖活性。有研究表明蘆丁[5-8]、槲皮素等具有潛在的抑制α-糖苷酶活性[9-10]。

就桑葉而言，采收期不同，藥材各組分含量差異也較大[11-13]。自古以來桑葉的采集時間習慣在秋季霜降后采收，歷來多認為桑葉以老而經霜者為佳，故入藥用多為冬桑葉，亦稱“霜桑葉”或“經霜桑葉”。因此，本文在此基礎上，將α-糖苷酶抑制活性與其總指標成分含量相銜接，設計了基于α-糖苷酶抑制活性對桑葉中7種黃酮類成分的含量測定，并基于桑葉經霜采收的臨床習慣對不同產地及不同采收期的桑葉進行含量測定與活性的對比研究，擬為桑葉“經霜為上”的科學內涵的闡明，桑葉臨床用藥提供依據。

1 儀器與材料

Agilent 1200高效液相色譜系統（美國Agilent公司）；超純水器（Millipore公司，Mill-QⅡ型）；萬分之一天平（德國Sartorius公司，AX205）；旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠，XW-80A）；離心機（Sigma 3k15）；多功能微孔讀板機（Molecular Devices）；孵育箱 （Shel lab Model 1012 hybrdization oven）；pH 計（FiveEasyTM，Mettler Toledo）；96 孔酶標板（Corning）。

色譜純乙腈購于Merck公司（德國）；色譜純甲醇購于Fisher公司（美國）；色譜純甲酸購于Tedia公司（美國）；實驗用水為Milli-Q超純水；分析純甲醇購于天津市康科德科技有限公司；分析純磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉皆購于天津光復精選化工研究所。

蘆丁對照品、山奈酚對照品、紫云英苷對照品、異槲皮苷對照品、隱綠原酸對照品、桑皮苷A對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司；槲皮素對照品和阿卡波糖購于中國藥品生物制品檢定所；對硝基苯-α-D-吡喃半乳糖購于美國 sigma-Alorich公司；各對照品純度均大于98%。α-糖苷酶：EC:3.2.1.20，規格：50.95 U/mg，購于上海億欣生物技術有限公司。采集10批不同產地相同采收期霜桑葉100 g；不同采收時期的桑葉為采自天津中醫藥大學校園同一棵樹的不同日期的樹葉，每次采集100 g，經常艷旭研究員鑒定為桑科植物桑Morus alba L.的葉，常溫陰干后粉碎過100目篩、備用。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱為WELCH Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為 0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫條件為 0～5 min，95%～88%A；5～11min，88%～87%A；11～21，87%～85%A；21～22min，85%A；22～32min，85%～84%A；32～39min，84%A；39～41 min，84%～83%A；41～50 min，83%A；50～51 min，83%～82%A；51～61 min，82%A；61～69 min，82%～79%A；69～73 min，79%A；73～77 min，79%～78%A；77～78 min，78%A；78～86 min，78%～72%A；86～88 min，72%～68%A；88～92 min，68%～65%A；92～102 min，65%～62%A；流速為 1 mL/min；檢測波長：365 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：15 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取隱綠原酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚、異槲皮苷、紫云英苷、桑皮苷A對照品各適量，加純甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取0.500 g桑葉粉末，加80%的甲醇于10 mL容量瓶中（料液比1∶20），于37℃超聲30 min，靜置放冷，加80%甲醇補足至刻度，搖勻，14 000 rpm離心10 min，過濾，取上清液作為樣品溶液，置4℃冰箱中保存備用。

2.4 α-糖苷酶抑制活性測定 采用文獻報道[14]的方法配置底物溶液和酶溶液，檢測不同產地、不同生長期樣品供試液及各單體化合物對α-糖苷酶活性的影響。本實驗在96孔板上進行，設4個組，每個組3個復孔，分別為樣品空白組（Asb）、空白對照組（As）、樣品測定組（Acb）、對照組（Ac）。在樣品測定組中，先加入20 μL緩沖溶液和20 μL樣品溶液，再加入20 μL底物溶液，混勻后，加入20 μL酶溶液，振搖1 min，37℃下孵育15 min，加入0.2M碳酸鈉溶液終止酶反應，在酶標儀檢測波長405 nm下，測定吸光度值。樣品對α-糖苷酶抑制率按下公式計算：抑制率=[（Ac-Acb）-（As-Asb）]/（Ac-Acb）×100%，計算IC50。

3 結果與討論

3.1 桑葉提取方法的優化 本研究首先采用單因素分析方法，考察了提取溶劑（40%、60%、80%、100%甲醇），超聲時間（10、20、30、40 min），物料比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20） 對 7 種黃酮成分的提取的影響，確定提取溶劑為60%甲醇，超聲40 min、物料比為1∶20時最好。在此基礎上設計了提取溶劑（60%、70%、80%）；超聲時間（20、30、40 min）；物料比（1∶10、1∶15、1∶20）的三因素三水平正交實驗，以 7 種黃酮成分的總量為指標，并根據正交設計軟件采用L9（34）正交表設計正交實驗。結果顯示，方差分析F檢驗中3個因素時總量的影響都不顯著，因而采用直觀分析確定最佳條件，確定最佳的提取條件為：提取溶劑80%，超聲時間30 min，物料比1∶10。見表1。

表1 正交實驗直觀分析結果Tab.1 Visual analysis of the orthogonal experiment results

方差分析結果顯示物料比、超聲時間及提取溶劑對本實驗評價指標無顯著性差異。物料比1∶20時提取相對完全，故本實驗采用提取溶劑80%，超聲時間30 min和物料比為1∶20進行樣品制備。見表2。

表2 方差分析結果Tab.2 Analysis of variance

3.2 方法學考察

3.2.1 線性關系 將上述對照品儲備液以甲醇稀釋，得濃度分別為蘆丁 500 μg/mL，槲皮素 10 μg/mL，山奈酚 10 μg/mL，紫云英苷 300 μg/mL；異槲皮苷 500 μg/mL；桑皮苷 A 100 μg/mL；隱綠原酸200 μg/mL的混合對照品溶液，并將混合對照品液稀釋至不同濃度，注入色譜儀，記錄峰面積，以混合對照品液中各成分濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，求得線性回歸方程及線性范圍，見表3。結果表明各對照品在各自的濃度范圍內線性關系良好。

表3 標準曲線結果Tab.3 Results of standard curve

3.2.2 精密度 同一供試品溶液，連續進樣6次，以對照品峰面積進行計算，桑皮苷A，隱綠原酸，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷，槲皮素，山奈酚峰面積的RSD 值分別為 1.11%，2.32%，0.48%，0.8%，2.17%，0.66%和1.12%，結果表明精密度較好。

3.2.3 重復性 制備6份同一批次桑葉樣品供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積，計算峰7個化合物峰面積的RSD值，結果表明桑皮苷A，隱綠原酸，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷，槲皮素，山奈酚峰面積的RSD值分別為2.27%，0.35%，0.12%，1.84%，0.85%，0.57%，0.76%，表明所建立的分析方法重復性較好。

3.2.4 穩定性 取同一批次的桑葉供試品溶液分別在 0、2、4、6、8、12 、24 h 進樣分析，記錄峰面積，計算峰面積的RSD值。桑皮苷A，隱綠原酸，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷，槲皮素，山奈酚峰面積的RSD分別為 1.22%，0.4%，0.51%，0.76%，1.2%，0.29%，1.51%，表明樣品溶液在24 h內穩定性良好。

3.2.5 加樣回收率 精稱取已知含量的桑葉藥材0.25 g，分別精密加入等質量的7種標準品，按照樣品制備方法制備，計算方法提取回收率。桑皮苷A，隱綠原酸，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷，槲皮素，山奈酚的平均回收率分別為99.3%，91.0%，91.1%，90.8%，100%，102%，100%。RSD值分別為2.55%，3.25%，0.730%，0.950%，2.62%，2.36%，0.950%。上述結果表明，該方法可用于桑葉中7種化合物的提取。

3.3 樣品含量及抑制α-糖苷酶測定 精密稱取不同產地、物候期桑葉樣品，制備供試品溶液，利用所建立的分析方法對桑葉樣品進行了分析，測定桑葉中桑皮苷、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈酚含量，結果見表4和表5。典型7種混合標準品和桑葉樣品色譜圖如圖1所示。

3.4 不同采收期及產地桑葉α-糖苷酶抑制活性與7種黃酮類成分總含量相關性研究 從表4和表5可知，不同采收期及不同產地樣品間7種成分含量有較大差異。其中，云南產地的桑葉樣品7種成分總含量較高。不同產地桑葉樣品7種黃酮類成分總含量與其α-糖苷酶抑制活性基本呈正相關關系（圖2），提示可以采用7種黃酮類成分作為桑葉降糖活性的評價指標，其總含量越高，α-糖苷酶抑制活性越強；研究結果表明不同采收時期的桑葉樣品中7種黃酮類成分與α-糖苷酶抑制活性相關性較差，可能與不同時期的桑葉中化學成分組成變化有關。結合天津市氣候特點，可以把所采集的樣品分為3個時期，10.11-10.28為霜降期，而4.10-10.11為霜降前期、10.28-11.23為霜降后期。發現桑葉7種黃酮類成分總含量及α-糖苷酶抑制活性在霜降前期和后期均呈現下降的趨勢，不同采收期桑葉的7種黃酮類成分總含量變化規律為霜降＞霜前＞霜后（圖3B）；α-糖苷酶抑制活性變化規律為霜前＞霜降＞霜后（圖3A）。從表5可知，盡管在4月份桑葉其7種黃酮類成分高于霜降時期，但其桑葉產量較低，而霜降期桑葉產量較高，推測可能是古人選擇了霜降為桑葉最佳采收期的原因。本研究為初步探索桑葉“經霜者為佳”科學內涵、資源開發利用、質量標準的建立提供科學依據。

表4 不同產地樣品中7種黃酮含量和抑制α-糖苷酶測定結果Tab.4 Determination of 7 flavonoids andα-glucosidase inhibitory activity in samples from different habitats

表5 不同采收期樣品中7種黃酮含量和抑制α-糖苷酶測定結果Tab.5 Determination of 7 flavonoids andα-glucosidase inhibitory activity in samples from different times

圖1 混合對照品色譜圖(A)和樣品色譜圖(B)Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and samples(B)

4 結論

圖2 不同產地桑葉樣品α-糖苷酶抑制活性與7種黃酮類成分總含量Fig.2 Relation of α-glucosidase inhibitory activity(1/IC50)and total content of 7 flavonoids of mulberry leaf from different areas

本研究建立了桑葉中桑皮苷A、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈酚7種黃酮類成分同時測定HPLC方法，發現不同產地桑葉7種黃酮類成分總含量與其α-糖苷酶抑制活性呈正相關關系；通過不同物候期的桑葉化學成分及降糖活性研究，發現7種黃酮類成分總含量及α-糖苷酶抑制活性在霜降前期和后期均呈現下降的趨勢，而在霜降時期桑葉化學成分及降糖活性均較高，從化學成分和活性兩個角度為初步闡釋桑葉“經霜為上”的科學內涵、桑葉的臨床應用、質量控制及桑葉資源的二次開發提供參考。

圖3 不同采收期桑葉樣品α-糖苷酶抑制活性及7種黃酮類成分總含量變化規律Fig.3 Change of α-glucosidase inhibitory activity and total content of 7 flavonoids of mulberry leaf from different collected times

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