針刺對腦缺血再灌注大鼠梗死灶邊緣區頂葉皮質 TLR9、TNF-α、IRF7和 IFN-β 的mRNA表達的影響*

許軍峰 ，張 浪 ，田 騫 ，郭士明 ，李文博

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸特需科，天津 300193；2.中國中醫科學院博士后科研流動站，北京 100700；3.陜西省子長縣人民醫院，子長 717300；4.天津市東麗區中醫院，天津 300399；5.天津中醫藥大學，天津 300193）

腦梗死是臨床上的一種常見病、多發病，其發病率占腦卒中60%～80%[1]，腦缺血損傷導致中樞神經系統神經細胞缺失和神經網絡損傷，患者神經功能損傷引起運動功能不同程度受限[2]。目前臨床上治療腦卒中后并發癥的方法很多，其中針刺法在治療缺血性腦卒中康復期不存在血腦屏障[3-6]。本研究將從Toll樣受體9（TLR9）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素調節因子 7（IRF7）、干擾素-β（IFN-β）因子的mRNA表達方面闡釋針刺治療中風病的機制，研究針刺的抗損傷修復及腦保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與取材 選擇健康成年雄性SD大鼠36只，體質量280～300 g，SPF由中國醫學科學院實驗動物中心配送。按隨機數字表分為模型組（即手術組）、假手術組和針刺組，每組12只大鼠。3組按再灌注時間點和腦組織取材來源分為：6 h缺血側（I1）、5 d缺血側（I2）兩個亞組，每個時間段各6只。I1和I2在梗死灶邊緣區頂葉皮質取材。

1.2 大鼠腦缺血再灌注模型的建立 大腦中動脈閉塞模型參照改良Zea Longa氏線栓法[7]制備右側腦缺血，在大腦中動脈阻塞90 min時，將線栓拔出至頸外動脈內達到再灌注。假手術組除不插入魚線外，其他操作與手術組相同。神經病學評分參考Zealonga的5級4分法標準[8]。有效模型在1～4分。造模后的動物會有神經功能缺損癥狀，如偏癱等。如有腦出血死亡者剔除。

1.3 針刺取穴及針刺方法 根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”，選用內關、水溝、三陰交3個穴位，取相應脅下固定點作為非穴點，使用蘇州醫療用品廠生產的“華佗牌”毫針，40 mm×0.32 mm。先刺雙側內關：直刺0.3～0.5寸（同身寸，下同），施捻轉提插瀉法1 min；再刺水溝：斜刺0.3～0.5寸，用重雀啄法施手法4～6次；然后刺患側三陰交，施提插補法，使患側下肢抽動3次。非穴點針刺，施平補平瀉手法1 min。6 h組僅針刺1次，5 d組針刺隔天1次，共3次。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測 對大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開顱取腦，放于-20℃速凍30 min，組織切片自端腦前端開始，從前往后，每片厚1.5 mm。取大鼠前囟冠狀面雙側額頂葉皮質，將其分別分裝于清潔標本管中；液氮速凍后置-80℃保存備用。用超純RNA試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取樣本組織中的總RNA。實驗操步驟參考說明書操作；取5 μL RNA，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）進行反轉錄。實驗操作步驟參考說明書操作。用ABI7500fast型熒光定量PCR儀，數據的相對定量分析采用2-△△CT法。根據Real Time PCR原始檢測結果，按照2-△△CT相對定量計算公式，即

F=2-(對照組目的基因平均Ct值-對照組看家基因平均Ct值)-（待檢樣品月的基因平均Ct-待檢樣品看家基因平均Ct值）

計算出各樣品目的基因相對定量的結果，即其他各個樣品相對于對照樣品（M51R），目的基因mRNA轉錄水平的差異。

1.5 統計學分析 采用SPSS for WindowsVer.18.0統計軟件對所得數據進行統計學處理。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組內前后比較若滿足正態分布用配對t檢驗，若呈偏態分布用配對秩和檢驗。多組間比較若滿足正態分布采用單因素方差分析，若呈偏態分布采用秩和檢驗，p＜0.05為有統計學差異。

2 結果

針刺對腦缺血再灌注大鼠梗死灶邊緣區頂葉皮質 TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA 表達的影響統計如下。

2.1 針刺對TLR9 mRNA表達的影響 不同分組、不同時間段、不同側TLR9信號通路mRNA的表達對比均無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 針刺對TLR9 mRNA表達的影響Tab.1 Effect of acupuncture on the expression of TLR9 mRNA

表1 針刺對TLR9 mRNA表達的影響Tab.1 Effect of acupuncture on the expression of TLR9 mRNA

組別 動物數 6 h 5 d模型組 6 0.724 0±0.3245 5 0.372 5±0.4207 4針刺組 6 0.608 0±0.1285 3 0.890 0±0.7658 0假手術組 6 0.364 0±0.1902 1 0.708 0±0.1355 4

2.2 針刺對TNF-α mRNA表達影響 模型組6 h、假手術組6 h、針刺組6 h、模型組5 d與針刺組5 d對比（p＜0.05），均存在統計學差異，針刺組5 d TNF-α mRNA表達明顯升高。見表2。

2.3 針刺對IRF7 mRNA表達的影響 模型組5 d、假手術組5d與模型組6h比有統計學差異（p＜0.05），兩者較模型組6 h明顯降低。見表3。

表2 針刺對TNF-α mRNA表達的影響Tab.2 Effect of acupuncture on the expression of TNF-α mRNA

表2 針刺對TNF-α mRNA表達的影響Tab.2 Effect of acupuncture on the expression of TNF-α mRNA

注：與針刺組 5 d 比較，*p＜0.05。

組別 動物數 6 h 5 d模型組 6 0.090 0±0.021 21* 0.337 5±0.443 20*針刺組 6 0.178 0±0.048 68* 1.348 0±0.992 20假手術組 6 0.296 0±0.187 43* 0.464 0±1.176 00*

表3 針刺對IRF7的mRNA表達的影響Tab.3 Effect of acupuncture on the expression of IRF7 mRNA

表3 針刺對IRF7的mRNA表達的影響Tab.3 Effect of acupuncture on the expression of IRF7 mRNA

注：與模型組 6 h 比較，*p＜0.05。

組別 動物數 6 h 5 d模型組 6 2.368 0±0.986 39 0.272 5±0.485 07*針刺組 6 1.648 0±0.513 59 1.206 0±1.405 68假手術組 6 0.890 0±0.326 50 0.562 0±0.467 25*

2.4 針刺對IFN-βmRNA表達的影響 模型組6h、針刺組6 h、假手術組6 h組和針刺組5 d對比，存在統計學差異（p＜0.05），針刺組 5 d IFN-β mRNA表達明顯增加。見表4。

表4 針刺對IFN-β mRNA表達的影響（Tab.4 Effect of acupuncture on the expression of IFN-β mRNA

表4 針刺對IFN-β mRNA表達的影響（Tab.4 Effect of acupuncture on the expression of IFN-β mRNA

注：與針刺組 5 d 比較，*p＜0.05。

組別 動物數 6 h 5 d模型組 6 0.984 0±0.727 14* 0.692 5±0.383 26針刺組 6 0.946 0±0.310 29* 2.508 0±1.355 31假手術組 6 0.220 0±0.111 36* 0.656 0±0.140 29

3 討論

腦卒中目前臨床上作為一種常見病，針刺治療缺血性腦神經損傷元具有保護作用已被大量臨床與實驗所驗證，在臨床上取得顯著療效[9-11]。本實驗以腦缺血后再灌注大鼠的TLR9 mRNA信號通路作為研究目標，研究針刺對腦缺血再灌注大鼠梗死灶邊緣區頂葉皮質在不同時間點 TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA 表達的影響[12]，闡述針刺治療中風病機制所在，結果顯示針刺法增強神經保護因子IFN-β mRNA的表達。

腦缺血再灌注后6 h炎癥因子IRF7、IFN-β mRNA明顯增高，而因子TLR9和TNF-α增高不明顯，可能與其啟動時間不同有關。本研究尚不能表明該針刺能抑制TLR9 mRNA的表達，究其原因，腦缺血再灌注后TLR9信號通路被激活，隨著機體自身的愈合，或者有效藥物與有效方法的治療，TLR9 mRNA的表達會降低，或許5 d尚在腦缺血再灌注后TLR9 mRNA表達的峰值之前。本針刺法5 d TNF-α mRNA表達對比明顯增加，不能證明本針刺法能抑制TNF-α mRNA表達，甚至會誘發腦水腫、損害腦神經，故腦缺血再灌注損傷后至少5 d內不宜針刺。本研究表明該針刺法不能使IRF-7因子的mRNA表達下降，說明腦梗死有一定的自限性。IFN-β是一種神經保護因子，腦缺血再灌注后IFN-β mRNA表達增加，表明本針刺法能明顯增強神經保護因子IFN-β mRNA的表達。

本實驗從TLR9 mRNA信號通路的角度闡述針刺治療中風的機制。腦缺血再灌注損傷大鼠經過針刺干預后，神經保護因子IFN-β信號mRNA的表達增強，神經功能活動障礙改善，能夠減少腦缺血再灌注損傷影響的程度[13]。提示針刺對腦缺血大鼠的神經細胞保護機制之一，可能是通過增強神經保護因子IFN-β mRNA的表達而實現的。研究結果顯示，每組6個樣本，且標準差較高，實驗過程中的質控有待提高，所得到的結論需要進一步探討和驗證。

參考文獻：

[1]中華醫學會神經病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經科雜志，2015,48(4)：246-257.

[2] Flynn RW，Mac Water RS，Doney AS.The cost of cerebral ischaemia[J].Neuropharmacology，2008，55(3):250-256.

[3] 楊珊莉,江一靜,陶 靜,等.電針對缺血性腦卒中再灌注損害大鼠CREB表達的影響[J].世界中醫藥,2014,9(2):221-223.

[4] 陳 鋒，嚴志康，楊 波.頭皮針對腦缺血再灌注大鼠缺血區腦組織bcl-2、Caspase-3蛋白表達以及血液流變的影響[J].針刺研究，2009，34(6)：363-367.

[5] 孔立紅，孫國杰，劉勝洪.針刺對腦缺血再灌注大鼠海馬組織核轉錄因子-κB 表達及含量的影響[J].針刺研究，2006，31(3)：140-144.

[6] 徐 虹，洪禮傳，黃艷秋，等.針刺對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質金屬蛋白酶、細胞間黏附分子表達的影響[J].基礎醫學與臨床，2010，30(7)：731-736.

[7]王 順，張 靜.不同經穴針刺對腦卒中偏癱痙攣大鼠血清cAMP、cGMP含量影響的研究[J].中國中醫藥科技，2012，19(1):54-55.

[8] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91

[9] 張春紅,王 舒,石學敏,等.醒腦開竅針法對腦梗死模型大鼠腦組織c-fos基因表達的影響[J].天津中醫藥,2004,21(3):210-213.

[10]何 娜,朱春雷,何 欣.針刺治療腦梗死對神經元保護作用機制的實驗研究[J].當代醫學,2012,18(9):3-4.

[11]余亞娟.針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經細胞凋亡的影響[J].咸寧學院學報，2009，23(4):277-279.

[12]謝 芬，方建業，潘經銳，等.腦缺血再灌注早期梗死灶邊緣區TLR9信號通路的活化[J].中國神經精神疾病雜志，2011,37(10)：596-597.

[13]許軍峰，張 浪，田 騫，等.針刺對腦缺血再灌注大鼠皮質缺血半暗帶細胞超微結構的影響[J].長春中醫藥大學學報，2016,32(3)：455-457.