昆明地區漢族人群FAS/FASL基因多態性與糖尿病視網膜病變的相關性分析

張 嫻，李園園，李雪江，張 燕，胡廷華，馬俊彥

昆明地區漢族人群FAS/FASL基因多態性與糖尿病視網膜病變的相關性分析

張 嫻1，李園園1，李雪江1，張 燕1，胡廷華2，馬俊彥2

目的探討Fas-1377G>A和FasL-844C>T基因多態性與昆明地區糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)的相關性。方法采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)限制性片段長度多態性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技術對31例DR患者(病例組)和23例糖耐量正常的對照者(對照組)進行FAS-1377、FASL-844兩個基因多態性檢測基因型及等位基因頻數分布。結果fas-1377位點3種基因型AA、AG和GG在對照組研究對象中的頻數分別為9.7%、54.8%和35.5%，在病例組的頻數分別為13%、52.2%和34.8%，基因型頻數分布組間比較差異無統計學意義(fisher=0.282,P=1.0)；等位基因A和G在對照組中的頻數分別為37.1%和62.9%，在病例組的頻數分別為39.1%和60.9%，等位基因型頻數分布組間比較差異無統計學意義(χ2=0.046,P=0.829)。fasL-844位點3種基因型CC、CT和TT在對照組研究對象中的頻數分別為41.9%、45.2%和12.9%，在病例組的頻數分別為60.9%、34.8%和4.3%，基因型頻數分布組間比較差異無統計學意義(fisher=2.178,P=0.334)；等位基因C和T在對照組中的頻數分別為64.5%和35.5%，在病例組的頻數分別為78.3%和21.7%，等位基因型頻數分布組間比較差異無統計學意義(χ2=2.393,P=0.122)。用logistic回歸分析4種模型， FasL-844基因攜帶T者患病例組風險可能升高，TC,TT,TC+TT,TOR值分別為1.885，4.308，2.154，1.980(P>0.05)，無統計學意義。同時攜帶FAS-1377GG和FASL-844 CT/TT基因型的風險較同時攜帶FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患DR發病風險(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261)；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，差異均無統計學意義。結論Fas-1377、FasL-844基因多態性位點可能與昆明漢族DR易感性無相關性，可能不是該地區DR的常見遺傳易感因素。

糖尿病視網膜病變；Fas-1377；FasL-844；基因多態性

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是最常見造成視力減退或失明的眼病，流行病學研究表明，5年以上的糖尿病患者約51.3%發生視網膜病變[1]，嚴重者可導致失明，其致病性尚未完全闡明，目前認為多種因素，包括遺傳、環境因素及其相互作用與該病的發生密切相關，隨著DR遺傳學研究的發展，基因多態性與DR的關系倍受關注?，F有報道DR有關的染色體突變位點已達20余個，其中FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因多態性與DR的關系己在白種人中得到證實[2]，但在不同國家及地區人群中患病率是否存在差異尚未報道。筆者通過PCR-RFLP，并結合DNA測序來探討該基因組多態性在中國云南昆明地區2型糖尿病視網膜病變人群中的相關性，為今后FAS/FASL基因多態性在2型糖尿病患者視網膜病變的病因研究及群體篩查奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2012-11至2015-12在武警云南總隊醫院就診的2型糖尿病患者82例，經眼底鏡和(或)眼底熒光造影檢查確診DR者病例組31例(DR組)，其中男17例，女14例，年齡(57.89±13.42)歲，糖尿病病程8.5～36 (23.11±3.3)年；在我院體檢的正常對照組(NC組)23例，男11例，女12例，年齡(55.63±4.17)歲。檢測者均來自云南省昆明地區居住的漢族人群，記錄2組的性別、年齡、身高、體重均無統計學差異。

1.2 實驗步驟

1.2.1 DNA提取 取外周靜脈血5ml，蛋白酶K處理后苯酚氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2 DNA引物 見表1。

表1 FAS/FASL DNA 引物序列

1.2.3 PCR反應體系(20 μl體系)及反應條件 PCR反應體系為20 μl，包括10×Buffer(Mg2+Plus)2 μl，Taq酶(5 U/μl)及dNTP(10 mM)各0.2 μl，上下游引物各0.4 μl ( 20 pmol /μl) ，DNA模板1 μl ( 50～300 ng /μl) ，不足部分由雙蒸水補充。FAS-1377位點PCR擴增參數: 預變性95 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，退火FAS63 ℃，FASL68 ℃,30 s，延伸72 ℃，30 s，變性、退火、延伸40個循環后，再次延伸72 ℃，7 min。FASL-844位點PCR擴增參數: 預變性95 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，退火68 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s，變性、退火、延伸40個循環后，最后72 ℃延伸7 min。

1.2.4 酶切反應體系 取5 μl PCR產物加0.5 μl限制性內切酶Apal(Fermentas公司)雙蒸水補足至10μl，恒溫箱37 ℃水浴過夜。

1.2.5 DNA測序 酶切產物在4%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化，純化產物雙向測序，采用測序儀器3730XL (BigDye Version3.1,Applied Biosystems)，用Sanger雙脫氧鏈終止法進行DNA測序，觀察結果。

1.3 統計學處理 采用spss16.0軟件對數據進行處理，兩組間比較采用t檢驗及協方差分析；應用fisher確切概率法進行基因型分布的Hardy-Weinberg平衡性檢驗，病例組與對照組間基因型與等位基因型分析的Fisher檢驗、logistic回歸分析，并對成組資料進行相關分析；對計數資料進行χ2檢驗和非條件logical回歸分析FAS/FASL基因多態性與疾病的相關性。以P<0.05作為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 DNA測序 PCR擴增產物FAS長度為284 bp FASL長度為401 bp，且條帶清晰，可用于后續酶切反應(圖1、2)。

2.2 兩組SNP基因型和等位基因分布 基因型和等位基因頻數分布在對照組和病例組研究對象中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=1.061，P=0.588；χ2=0.028，P=0.986)，具有群體代表性。

圖1 FAS基因-1377C>T位點PCR產物電泳圖

M：代表50bp遞增的DNA標記物(Marker)，1、2、3、4、5、6、7、8 代表G/A 基因型只有284 bp 一條片段

圖2 FASL基因-844C>T位基因型PCR產物電泳圖

M：代表50bp遞增的DNA 標記物(Marker)，1、2、3、4、5、6、7、8 代表C/T基因型只有401 bp一條片段

病例組和對照組研究對象基因型、等位基因頻數分布組間比較差異均無統計學意義(fisher=0.282,P=1.0)、(χ2=0.046,P=0.829)、(fisher=2.178,P=0.334)、(χ2=2.393,P=0.122)。詳見表2，表3。

表2 兩組患者FAS-1377 G/A SNP基因型和等位基因分布 (n；%)

注：P>0.05，在病例組合對照組中無統計學意義。①表示有兩個單元格的理論頻數<5,采用fisher確切概率值

表3 兩組患者FASL-844 C/T SNP基因型和等位基因分布 (n；%)

注：P>0.05，在病例組合對照組中無統計學意義。①表示有兩個單元格的理論頻數<5,采用fisher確切概率值

2.3 用logistic回歸分析4種模型， FasL-844基因攜帶T者患PDR風險可能升高，TC,TT,TC+TT,T，OR值分別為1.885，4.308，2.154，1.980，P>0.05，無統計學意義(表4，表5)。

表4 病例組和對照組間FAS-1377G/A SNP的基因型及等位基因分布 (n；%)

表5 病例組和對照組間FASL-844C/T SNP的基因型及等位基因分布 (n；%)

2.4 同時攜帶FAS-1377GG和FASL-844CT/TT基因型的風險較同時攜帶FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患增殖期2型糖尿病視網膜病變發病風險(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261))；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，P均>0.05,無統計學意義(表6)。

表6 糖尿病視網膜病變病例組和對照組間FAS-1377&FASL-844的基因型及等位基因分布 (n；%)

3 討 論

近年來，DR致病基因多態性的研究不斷深入，現已篩選出與發病相關聯的基因有數十種，如白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)基因、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)基因、血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)基因等，這些基因在參與DR的發生與發展過程中有不同程度的相關性[3]。如此多的基因多態性與DR的發生發展相關聯，說明DR(DR不分1型和2型)是發病機制眾多、由多種因素參與并與遺傳相關的一組基因多態性疾病[4]。

Fas基因(10q24.1，又名CD9/APO-1),屬于腫瘤壞死因子/神經生長因子受體家族[5]。是含有325個氨基酸的膜蛋白。Fas基因為FasL基因的受體，FasL是以三聚體的形式存在,必須有3個Fas受體與1個FasL結合,通過Fas胞內的死亡結構域與FADD(fas-associated protein with death domain)梭基端的死亡結構域相互連接,募集細胞中的FADD,同時與Caspase-8酶原中的死亡效應結構域相互作用,形成死亡誘導信號復合體(death-inducing signing complex,DISC)[6]，啟動凋亡程序,激活下游分子鏈,降解細胞蛋白質、骨架和核酸等,目前認為這可能是糖尿病視網膜毛細血管周細胞調亡的重要執行途經[7]。FAS/FASL基因變異型增加DR的患病風險的原因是[8]：Fas/FasL基因啟動子區的單核苷酸多態(SNPs)破壞了Fas基因低表達，出現Fas基因的高表達，因此FAS/FASL的結合啟動了視網膜周細胞凋亡[9]。

本文提示 FasL-844基因攜帶T者患DR風險可能升高，TC,TT,TC+TT,TOR值分別為1.885，4.308，2.154，1.980，P>0.05，無統計學意義。攜帶FAS-1377GG和FASL-844 CT/TT基因型的較同時攜帶FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患糖尿病視網膜病變發病風險(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261)；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，P均>0.05,無統計學意義。本實驗在病例組及對照組中未發現與FAS/FASL基因的相關性，由此說明該位點相關性確實很低。初步認為存在以下問題：首先本組分析篩查樣本量較少，FAS/FASL基因多態性啟動的細胞凋亡與DR的關系有待進一步驗證。其次FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因存在多態異質性，如視網膜母細胞瘤與該位點的相關性已確認，但房水、視網膜檢測的相關性是否存在差異并未得到驗證，而靜脈血檢測與該位點的相關性較低；再次Itoh N等對不同人種DR的基因SNPs位點與之發生的相關性進行了研究[10]：認為FAS/FASL基因自身存在高度遺傳異質性，在不同地區和不同種族人群的遺傳環境差異性導致不同組織，不同生活習慣、不同背景因素等方面差異較大[11]，甚至在亞洲人群中也不盡相同，如AR基因(-106CC)基因型可能是美國及巴西2型糖尿病患者的易感基因[12]；在印度某地區2型糖尿病與VEGF基因啟動區,5′-UTR的基因多態性是DR的主要危險因素[13]，677C-T等位基因可能是日本患者的DR易感基因[14]，說明同一基因在不同區域的致病性并不相同，或同一區域、不同民族對同一基因的易感性也不一樣。

本文結果提示FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因多態性可能不是中國云南昆明地區DR患者的常見易感基因。這是否因樣本量原因所致，還有待進一步增加樣本量，對糖尿病進行分型，并對房水、視網膜等不同部位進行FAS/FASL基因基因多態性的檢測，以多方位揭示FAS/FASL基因多態性與DR的關聯性。

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(2017-07-06收稿 2017-12-20修回)

AssociationofFAS/FASLgenepolymorphismswithdiabeticretinopathyinKunmingHanpopulations

ZHANG Xian1，LI Yuanyuan1，LI Xuejiang1，ZHANG Yan1,HU Tinghua2,and MA Junyan2.1.Department of Servicemen’s Wards;2.Department of Special Examination,Yunnan Provincial Corps Hospital of PAPF,Kunming 650111,China

ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of Fas promoter-1377 and FasL promoter-844 and diabetic retinopathy (DR) in Kunming Han populations.MethodsPolymerase chain reaction (PCR)and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) analysis techniques were used to screen the distribution of the genotypic and allelic frequencies of the Fas-1377 and FASL-844 gene among 31 patients with diabetic retinopathy and 23 healthy controls with normal glucose tolerance.ResultsThe frequencies of three genotypes-AA, AG and GG-at the Fas-1377 locus in the control group were 9.7%, 54.8% and 35.5%, respectively, compared to 13%, 52.2% and 34.8% respectively in the case group.There was no statistically significant difference in genotype frequency distribution between the two groups (fisher=0.282,P=1.0). Allele A and G frequency in the control group was 37.1% and 62.9% respectively, but was 39.1% and 60.9% respectively in the case group. There was no statistically significant difference between the two groups in allele frequency distribution (χ2=0.046,P=0.829). Allele frequencies of C and T in the control group were 64.5% and 35.5% respectively, compared with 78.3% and 21.7% in the case group. Logistic regression analysis of the four models suggested that FasL-844 gene T could increase the risk for diabetic retinopathy. The values of TC, TT, TC+TT and TOR were 1.885, 4.308, 2.154 and 1.980 respectively,P>0.05, so there was no statistically significant difference. At the same time,carrying FAS-1377 GG and FASL-844 CT/TT gene was more likely to increase the risk of diabetic retinopathy than carrying FAS-1377 CC genotype GG and FASL-844(OR=1.143 (95%CI=0.141-9.289);OR=0.343 (95%CI=0.052-2.261);OR=2.286 (95%CI=0.185-28.186),Pvalues>0.05.ConclusionsNeither Fas-1377 nor FasL-844 gene polymorphisms have any relationships with diabetic retinopathy in Kunming Han populations, and neither of them may be the susceptible gene of diabetic retinopathy.

diabetic retinopathy; Fas-1377; FasL-844; gene polymorphism

張 嫻，碩士，主治醫師。

650111 昆明，武警云南總隊醫院：1.軍人病區，2.特檢科

R774.1

梁秋野)