茶葉花青素的研究進展

劉林峰，向 奕，劉 安，肖文軍，龔志華

（湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128）

花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物，是植物的主要呈色物質[1]。茶葉花青素由于具有苦味，影響茶葉品質，使得上世紀的研究偏向于減少花青素的積累，如闞能才[2]通過探究光照和氮營養的紫芽形成的關系來減少茶葉花青素的積累，所以紫芽茶品質欠佳也導致一直鮮有人關注。

花青素在茶樹中具有普遍存在性，80%以上的茶樹含有花青素，尤以紅紫色茶樹為主，也存在于部分綠色芽葉中。紅紫色茶樹葉片在茶樹中較為常見，夏季強光高溫條件下，高海拔的群體茶園中發生率相當高，是茶樹抗逆生理的表現形式之一[3]。陸羽《茶經》中記載：“茶者，紫為上”,紫即“紫茶”，即富含花青素的紫色芽葉。茶葉花青素具有很強的生物活性，其可廣泛用于食品、飲料、醫藥、化工和紡織等行業。近年來隨著茶葉科技的發展及市場需求的變化，富含天然色素的紫芽茶的關注度逐年升高，成為近年茶葉功能成分研究的熱點。目前，國內外關于茶葉花青素的研究主要集中在茶樹資源選育開發 、紫芽茶樹化學成分分析、合成途徑和調控機理、花色苷組分的分離純化鑒定[6]和花青素生物活性及產品開發[7-8]等方面。

1 花青素的化學結構

花青素的基本結構母核是2-苯基苯并吡喃[9]，其結構如圖1所示。

圖1 花青素的基本結構Fig.1 The basic structure of anthocyanins

R1和R2是H、OH或者OCH3，R3是糖基或H,R4是糖基或OH。不同取代基組合成常見的6類天然色素。沈曉佳[10]通過LC-MS及HPLC保留時間確定了4種天然紅色茶葉花青素提取物為飛燕草-3-0-廣半乳糖苷和矢車菊-3-0-^5-半乳糖苷。通過LC-MS、NMR和高分辨率質譜測定了飛燕草-3-0|D-（6-(E)-對香豆酸）吡喃半乳糖苷和矢車菊-3-0|D-（6-(E)-對香豆酸）吡喃半乳糖苷。李智[11]等建立了茶樹紫色芽葉花青素 HPLC 的分析方法，運用 HPLC-DAD-MS/MS聯用技術，初步推測了茶樹紫色芽葉花青素中 5個主要組分，分別為：飛燕草-3-半乳糖苷、矢車菊-3-半乳糖苷、飛燕草-3-蕓香糖苷、矢車菊-3-蕓香糖苷和天竺葵-3-蕓香糖苷。

2 茶葉花色苷的理化性質

植物花青素[9]易溶于水和乙醇、甲醇等醇類化合物，在pH小于或等于3的酸性條件下穩定；不溶于乙醚、氯仿等有機溶劑，遇醋酸鉛試劑會沉淀，并能被活性炭吸附，其顏色隨pH值的變化而變化，pH＜7呈紅色，pH在7～8時呈紫色，pH＞11時呈藍色。植物花青素多采用酸性的甲醇、乙醇、水等極性溶劑提取，深色花青素有兩個吸收波長范圍，一個在可見光區，波長為465～560 nm，另一個在紫外光區，波長為270～280 nm。 目前在植物中已知的花青素有20多種，茶葉中的花青素主要有天竺葵色素、矢車菊色素和飛燕草色素等。羅海輝[12]測定了茶葉中花青素的部分理化性質，茶葉花青素含量一般占干物的0.01%左右，紫色芽葉可高達0.5%～1.0%，花青素類物質的顏色隨pH值的變化而變化，茶葉細胞液呈酸性，所以當茶葉芽葉花青素含量較高時，芽葉呈紅紫色。紅紫色芽葉的形成便是花青素積累較多的標志。

3 茶樹紫芽花色苷代謝機制及富集特性

3.1 代謝機制

茶葉花青素是由查爾酮（chalcone）合成，查爾酮異構酶（CHI）催化查爾酮異構化為柚皮素。柑橘素同時是花青素和兒茶素合成的中間產物，花青素和兒茶素等多酚類物質共有一系列合成途徑，所以紫芽茶花青素代謝與其他多酚類合成的相互關系值得探究。

植物花青素的基本代謝途徑已較為清楚[13]。目前已成為研究植物次生代謝基因表達和調控的模式途徑。張寧[14]等初步建立了代謝調控機制模型，但茶葉花青素的合成代謝研究報道較少。金琦芳[15]、李智[11]等對光照等環境因子調控茶樹紫色芽葉形成的分子機制進行了初步研究，表明茶葉花青素的積累除了遺傳背景的差異，還受到光照、溫度、氮素的影響。趙磊[16]對初步測得的茶樹基因組中轉錄因子基因進行生物信息學分析，并利用煙草遺傳轉化體系對茶樹花青素還原酶基因功能進行驗證，通過qRT-PCR對轉基因煙草中類黃酮合成途徑相關基因進行分析，結果顯示，在轉CsMYB5-2的煙草花中ANR基因的表達量明顯上升。周瓊瓊[17]的研究從生理生化和分子水平方面比較了茶樹同一時期不同發育程度紫化芽葉與成熟綠色葉片的差異，表明9 個花青素合成途徑關鍵酶基因中PAL、C4H、CHS、CHI、F3HF3'H、F3'5'H、DFR和ANS在幼嫩紫葉花青素合成的相關性。通過研究總結得到茶葉花色苷的合成主要途徑如下（圖2）。但花青素代謝途徑的關鍵酶以及主要路徑目前尚不明晰，仍有待進一步的研究。

3.2 富集特性

近年來國內外在選育高花青素品種上取得一些成果，云南省農業科學院茶葉研究所選育了第一個高花青素茶樹新品種“紫娟”并成為第一個品種權保護茶樹新品種[18]。劉富知[19]等對安化群體種進行研究發現4.35%的植株具有高花青素的特征，認為可以從有性群體種中篩選高花青素茶樹新品種。吳華玲等從云南大葉種和鳳凰水仙群體種中篩選了11個高花青素茶樹新品系，并對其進行了生物學及生化特征分析[20]，結果表明紅紫芽茶樹芽葉的色澤及其花青素含量同時受外界環境和遺傳因子的控制。蕭力爭等[21]研究了紫色深淺不一的5個特定紫芽品種茶樹春梢芽葉中的花色苷、茶多酚、黃酮類、氨基酸、咖啡堿、水浸出物、兒茶素總量、酯型兒茶素總量、簡單兒茶素總量等生化成分含量的差異，表明紫芽品種茶樹芽葉中的花青素含量與芽葉紫色深淺關系密切，芽葉紫色程度越深，花青素含量越高。李燕麗[22]等測定了不同季節“紫娟”茶花色苷質量分數，表明花色苷質量分數隨季節變化的幅度較大，呈春季到夏季花色苷質量分數急劇上升、夏季至秋季又趨于緩慢減少的規律。但就花色苷在不同品種、不同季節、不同部位的富集差異性仍少有人探究。

圖2 茶葉花色苷的合成主要途徑（Nesi et al.,2000；Mellway et al.,2009）Fig.2 The main synthetic route of anthocyanins

4 茶葉花色苷定性定量分析方法

茶樹芽葉中花色苷的定性分析方法有紙層析與薄層層析法、紫外－可見吸收光譜法[23]、高效液相色譜法及紅外吸收光譜法4種，定量分析方法有單一pH值法、差減法、pH示差法及高效液相色譜法[24-25]。 其中高效液相分析法能同時用于定量和定性。龔加順等[26]曾用HPLC分析茶葉中花色苷，表明HPLC分析茶葉中花色苷組分具有高效高靈敏的優點。李智[27]等運用HPLC-DAD-MS/MS 聯用技術初步推測了茶樹紫色芽葉花青素中5個主要組分分別為：飛燕草-3-半乳糖苷、矢車菊-3-半乳糖苷、飛燕草-3-蕓香糖苷、矢車菊-3-蕓香糖苷和天竺葵-3-蕓香糖苷。但目前的分析大都是以單一矢車菊為標準品，隨著茶葉花色苷分析的快速發展，這類分析方法顯得效率較低，有待更高效的方法。

5 茶葉花色苷提取、分離與純化技術

紫色茶葉花色苷提取工藝的選擇決定于提取的目的和花青素本身的組成。若以定性和定量分析為目的，則應選擇一種使色素處于天然狀態的提取方法。目前酸性極性溶劑提取茶葉花青素工藝被廣泛運用。Norihiko T.等[28]采用15%HCl-HOAc 從“Benibana-cha”品種的茶樹花中提取得到三種花青素。Jian-bin Li 等[29]也用50%冰乙酸-甲醇從“Hongkonensis”品種的茶葉中提取得到三種花青素。王秋霜[30]等采用超聲輔助、酸性乙醇提取法，綜合提取分離茶葉中的花青素物質，結果表明，乙醇濃度為80%、酸濃度為0.6%、料液比1/25、提取3次，可以獲得含量較高的花青素，提取率為378.25 mg/100 g。通過單因素和正交分析法確定最佳的提取條件，可以獲得含量較高的花青素。提取溶劑以甲醇為最佳，利用甲醇提取可以有效減少極性較小雜質對花青素純度的影響。但甲醇具有很強的揮發性和毒性，因此不能在食品生產實踐中應用，大規模生產常用檸檬酸作為花青素的提取溶劑。紫色茶葉花青素的提取分離應在其他植物中成熟的花青素的提取分離工藝的基礎上發展出高效經濟安全的提取分離方法。如趙爾豐[31]等人利用酶-超聲波輔助提取了藍莓果渣中的花青素，并且分別考察了纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶以及他們的復合酶的效果，實驗結果表明纖維素酶效果最好，得到的花青素提取率最高。

紫色茶葉花色苷分離純化工藝與花色苷理化性質相關，花色苷屬黃酮多酚類化合物，一般游離苷元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙醋、乙醚等極性溶劑中。現純化茶葉花青素的方法很多，一般采用層析柱[6]進行純化，新興的技術如高效逆流色譜在茶葉花青素純化中也有應用。在國外也有用Sep Pakcartridge C18柱、反相高效液相色譜（RP-HPLC）和半制備高效液相色譜等純化花青素及苷的[32]。其他植物花青素純化方法如膜分離技術、毛細管區帶電泳[33]和凝膠層析[34]等技術和多種純化方法聯用是純化茶葉花青素及苷的主要方向。

6 茶葉花青素生物活性及產品開發

據文獻報道，花青素具有抗氧化[35]、清除自由基 、護肝解毒、降血壓、降血脂 、消炎、抗癌[38]、治療心血管疾病[39]等多種生理功能。而茶葉花青素的生理功能也成了近年茶葉功能成分研究的一大熱點。Rashid[40]等的研究表明，肯尼亞紫芽茶花青素對緩和非洲錐蟲病特效藥對大腦的傷害有作用。Akira Murakami[41]等比較了高花青素種Sunrouge和藪北茶在抑制乙酰膽堿酯酶和抗結腸炎的生物活性。紫芽茶花青素的抗氧化活性基本得到驗證[42]。梁名志[43]對比分析了特種紫茶和云抗10號（對照）夏秋兩季的蒸青、烘青茶中降壓活性物質含量，初步提出黃酮類、鋅或花青素是特種紫茶的降壓特異物質。陳瓊等[44]通過動物實驗表明紫芽茶提取物有明顯抗炎作用，但未證實茶葉花青素為抗炎作用的特異性活性成分。王帥[45]在模擬人體生理條件下，用紫外、熒光光譜法研究了茶葉花青素中的天竺葵素及矢車菊-3-葡萄糖苷與人血清白蛋白的相互作用的分子機理，結果表明花青素粗品及各梯度洗脫成分均有良好的抗羥自由基、抗超氧陰離子自由基能力，所得5個組分對兩種自由基的平均清除率分別為兒茶素的1.4倍和4.5倍，在超氧自由基的抑制方面，花青素提取物顯示了更強的抑制能力。茶葉花青素的生物活性研究應與追求天然保健的市場需求相結合，挖掘出其特有的保健功能。

茶葉花青素可廣泛用于食品、飲料、醫藥、化工、紡織等行業。隨著高花青素新品種的選育，其產品的開發研究也隨之開展。花青素具有較高的保健作用，從高花青素茶葉中提取花青素，可以有效解決夏秋茶的利用問題[4]。同時紫芽茶樹的以其獨特的外形在園林觀賞價值上也有很大的開發空間[46-48]。鐘興剛等[49]結合黑茶的主要功效，探討用富含花青素的紅紫色茶葉來制作優質黑茶，并展望其市場前景廣闊。降低苦澀味，迎合市場需要，是紫芽茶產品的開發方向，如王建暉等[8]選用富含花青素的紫芽茶為主要原料，輔以甘草等原料，研制開發出風味俱佳、集保健與經濟價值于一體的紫芽茶保健飲料。

7 發展趨勢

近年來隨著天然色素研究熱度逐年提升和市場對天然保健茶產品的需求擴大，茶葉花青素及其苷的相關研究前景十分光明，但在紫色茶葉的花青素的純化方法、化學結構、生物活性、藥理作用和代謝調控等研究方向尚需有大量工作要做，為進一步開發和發揮其潛在經濟價值而積累數據。加大茶葉花青素在提取純化、生物活性、合成代謝和產品開發方面的研究對未來開發茶葉花青素資源具有重大意義。綜合分析前述研究進展，可以推測紫芽茶樹花色苷今后的綜合研究利用方向主要在以下幾個方面：（1）利用基因工程等技術選育高花色苷含量的茶樹資源；（2）在分子轉錄調控方面探究茶葉花色苷代謝機制；（3）建立高效、準確、廣泛的茶葉花色苷定性定量分析方法；（4）進一步探究紫芽茶樹花色苷的物質組成；（5）進一步系統探究茶樹花色苷富集特性與土壤、氣候等環境因素的關系；（6）闡明茶葉花色苷的生理活性并開發相關產品等。

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