槐豬FTO基因遺傳多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀相關(guān)性研究

許衛(wèi)華，趙殿強(qiáng)，黃 芬，李虹儀，張 茂，孫艷發(fā)

（1. 福建龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2. 福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364012）

隨著生活水平的日益提高，以肉質(zhì)鮮嫩、肌內(nèi)脂肪含量高、風(fēng)味濃厚為優(yōu)勢(shì)的地方品種及其雜交培育品種越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞，也引起了國(guó)內(nèi)外育種公司和投資機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。因此，對(duì)地方品種諸如脂肪沉積能力強(qiáng)、肌內(nèi)脂肪含量高，甚至早熟等優(yōu)秀性狀形成的分子遺傳基礎(chǔ)研究，顯得尤為迫切。此外，肥胖正成為一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性問題，豬作為一個(gè)良好的動(dòng)物模型，在研究人類肥胖候選基因的研究中發(fā)揮重要作用［1］。

FTO基因被發(fā)現(xiàn)與人類肥胖相關(guān)，因此也稱為肥胖基因［2］。該基因與兒童肥胖、成年人過(guò)度肥胖以及體重質(zhì)量指數(shù)相關(guān)［3-6］。FTO基因編碼氧化戊二酸依賴型去甲基化核酸酶，主要在大腦中表達(dá)，參與調(diào)節(jié)飲食［7］，同時(shí)在脂肪組織中也有表達(dá)，參與脂肪分解反應(yīng)，從而維持體內(nèi)脂肪能量平衡［8］。在小鼠模型中，F(xiàn)TO基因的過(guò)度表達(dá)會(huì)提高其采食量并導(dǎo)致肥胖，而且飼喂高脂食物給小鼠會(huì)產(chǎn)生葡萄糖耐受不良反應(yīng)［9］。豬FTO基因位于第六染色體上［10］，與背膘厚度、平均日增重等數(shù)量性狀基因座（QTL）毗連。研究發(fā)現(xiàn)，豬FTO基因5′-UTR區(qū)域、內(nèi)含子、外顯子以及3′-UTR區(qū)域均存在大量的單核苷酸突變（SNP）［11-18］。其中，F(xiàn)an等［11］發(fā)現(xiàn)巴克夏豬×大白豬資源群體中，該基因第一內(nèi)含子c.46-139A＞T及第三外顯子c.594C＞G位點(diǎn)各基因型與平均日增重及肌內(nèi)脂肪總量存在極顯著的相關(guān)性；Dvo?áková等［12］在多個(gè)雜交商品豬中發(fā)現(xiàn)該基因g.400C＞G位點(diǎn)（本研究中等同于c.594C＞G位點(diǎn)）等位基因C與背膘厚度顯著相關(guān)；Szydlowski等［13］在波蘭大白豬、波蘭長(zhǎng)白豬及大白×長(zhǎng)白雜交豬群中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因的5′-UTR區(qū)域g.167 T＞G位點(diǎn)與背膘厚度、腹脂重量顯著相關(guān)；陶新等［17］發(fā)現(xiàn)金華豬中c.594 C＞G位點(diǎn)存在遺傳多態(tài)性；楊攀等［18］發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)兩個(gè)地方品種（大圍子豬和寧鄉(xiāng)豬）與國(guó)外兩個(gè)品種（杜洛克豬和大白豬）在FTO基因第四內(nèi)含子g.276G＞T位點(diǎn)遺傳多態(tài)性存在較為明顯差異。

綜上所述可知，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究均發(fā)現(xiàn)FTO基因各遺傳突變位點(diǎn)遺傳多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性存在品種間差異，并且認(rèn)為FTO基因是一種潛在的分子遺傳標(biāo)記。槐豬是福建省首批列入“國(guó)家級(jí)畜禽品種資源保護(hù)名錄”的地方優(yōu)良品種豬，廣泛分布于福建省閩西南山區(qū)，主產(chǎn)地位于福建省上杭縣、漳平市、新羅區(qū)等縣市。槐豬具有早熟、耐粗飼、脂肪沉積能力強(qiáng)、肉質(zhì)好等特性。截至目前還沒有公開發(fā)表有關(guān)槐豬FTO基因遺傳多態(tài)性的研究報(bào)道。為此，本研究選擇3個(gè)遺傳多態(tài)性豐富且與肉質(zhì)性狀存在一定相關(guān)性的突變位點(diǎn)g.167 T＞G、c.46-139A＞T和c.594C＞G，研究其在槐豬品種內(nèi)的遺傳多態(tài)性及其與肌內(nèi)脂肪含量（Intramuscular Fat，IMF）、背膘厚度（Backfat Thickness，BFT）和眼肌面積（Loineye Area，LEA）等主要肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，為上杭槐豬優(yōu)質(zhì)系培育過(guò)程中開展肉質(zhì)性狀的分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在相同季節(jié)分6批次收集50頭體重為72.5～77.5 kg的槐豬（去勢(shì)公豬和母豬各半）樣本。槐豬育肥期飼喂條件相同，以采食煮熟地瓜皮并配飼槐豬專用顆粒精補(bǔ)飼料為主。采集倒數(shù)第3～4肋骨背最長(zhǎng)肌肌肉樣品，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于提取DNA的肌肉樣品保存于-80℃冰箱。

1.2 試劑

內(nèi)切酶EcoRⅠ、XapⅠ和Bsh1236Ⅰ購(gòu)自Fermentas公司；E.Z.N.A.? Tissue DNA Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PCR 試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；DNA Marker購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司。

1.3 基因組DNA提取

參照E.Z.N.A.? Tissue DNA Kit操作說(shuō)明書提取基因組DNA，用50～100 μL的洗脫緩沖液洗脫DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)［11，13］設(shè)計(jì)引物對(duì)，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。詳細(xì)的引物及PCR-RFLP信息見表1。

表1 FTO基因3個(gè)SNP的擴(kuò)增引物及PCR-RFLP相關(guān)信息

1.5 PCR-RFLP

根據(jù)PCR試劑盒配制反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 20～30 s、50～58℃20～45 s、72℃ 1 min，30～35 循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用15μL酶切體系，包括：PCR產(chǎn)物10 μL，限制性內(nèi)切酶1μL，10×buffer 2 μL，滅菌雙蒸水2μL。根據(jù)3種限制性內(nèi)切酶說(shuō)明書確定酶切反應(yīng)條件，酶切產(chǎn)物用2.0%～3%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 群體遺傳分析

基因頻率、基因型頻率以及多態(tài)信息含量（PIC）計(jì)算參照文獻(xiàn)［14］，其中，PIC值＞0.5為高度多態(tài)，0.25～0.5為中度多態(tài)，＜0.25為低度多態(tài)。通過(guò)卡方檢驗(yàn)（χ2test）判定各位點(diǎn)基因型是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

1.7 肉質(zhì)性狀測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

參照《豬肌肉品質(zhì)測(cè)定技術(shù)規(guī)范（NYT 821-2004）》測(cè)定肌內(nèi)脂肪含量、背膘厚度和眼肌面積。背膘厚度、眼肌面積以及反正弦變換后肌內(nèi)脂肪含量，用SPSS 20.0 One-Way ANOVA程序進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 槐豬FTO 基因PCR-RFLP結(jié)果

利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)槐豬FTO基因g.-167 T＞G、c.46-139 A＞T和 c.594 C＞G 等 3個(gè)位點(diǎn)的PCR片段進(jìn)行EcoRⅠ、XapⅠ和Bsh1236Ⅰ限制性酶切，按照表1的酶切結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的分型，酶切圖譜見圖1～圖3。

2.2 槐豬FTO 基因各RFLP位點(diǎn)遺傳多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

圖1 EcoRⅠ酶切848 bp PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 XapⅠ酶切197 bp PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

本試驗(yàn)對(duì)供試的50頭槐豬中43份（20公、23母）樣本成功進(jìn)行PCR-RFLP分型分析。對(duì)FTO基因3個(gè)SNP位點(diǎn)各等位基因型頻率、基因頻率、Hardy-Wenberg遺傳平衡以及多態(tài)信息含量（PIC值）進(jìn)行計(jì)算（表2），并與肌內(nèi)脂肪含量、背膘厚度、眼肌面積等肉質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（表3）。

圖3 Bsh1236Ⅰ酶切240 bp PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

從表2可以看出，槐豬FTO基因在g.-167 T＞G、c.46-139 A＞T和 c.594 C＞G 等 3個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)出一定的遺傳多態(tài)性，PIC值分別為0.276、0.343和0.235；3個(gè)位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型分別為GG、TT和GG基因型，優(yōu)勢(shì)等位基因分別為G、T和G等位基因。從表3可以看出，在g.-167 T＞G位點(diǎn)，TT基因型個(gè)體肌內(nèi)脂肪含量顯著高于GG基因型；c.46-139 A＞T位點(diǎn)，AA基因型個(gè)體背膘厚度顯著高于TT基因型；c.594 C＞G位點(diǎn)，各基因型個(gè)體在3個(gè)肉質(zhì)性狀上沒有表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。

表2 FTO 基因3個(gè)SNP的遺傳多態(tài)性

表3 FTO 基因遺傳多態(tài)性及其與槐豬肉質(zhì)性狀的相關(guān)性

3 討論

本研究中，槐豬FTO基因g.-167 T＞G位點(diǎn)，T等位基因有利于提高肌內(nèi)脂肪含量，這與Szydlowski等［13］的報(bào)道相近，該研究在波蘭大白豬（PLW）、波蘭長(zhǎng)白豬（PL）和一個(gè)合成品系（L990）豬群中發(fā)現(xiàn)T等位基因有降低肌內(nèi)脂肪含量的趨勢(shì)（P＞0.05），此外，T等位基因還顯著降低了雜交小母豬的背膘厚度、腹部脂肪含量和提高了瘦肉含量。然而，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)槐豬各基因型個(gè)體間在背膘厚度以及眼肌面積兩個(gè)性狀上存在顯著相關(guān)性。Chen等［20］發(fā)現(xiàn)肌間脂肪組織前脂肪細(xì)胞中FTO基因的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了細(xì)胞分化和脂肪沉積，提示FTO基因的選擇有可能通過(guò)影響FTO基因的不同表達(dá)水平，進(jìn)而影響肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增生和脂肪的沉積。槐豬c.46-139A＞T位點(diǎn)T等位基因有利于降低背膘厚度，而Fan等［11］發(fā)現(xiàn)T等位基因在巴克夏豬×大約克豬資源群中有利于提高平均日增重，如果認(rèn)為背膘厚度與平均日增重呈顯著負(fù)相關(guān)，則本研究中T等位基因降低背膘厚度的發(fā)現(xiàn)與該文研究結(jié)果相一致。本研究中并未發(fā)現(xiàn)c.594 C＞G位點(diǎn)各基因型在背膘厚度、肌內(nèi)脂肪含量和眼肌面積3個(gè)性狀上表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，而Fan等［11］在巴克夏豬×大約克豬資源群和Dvo?áková等［12］在梅山豬×皮特蘭F2資源群中均發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)和被研究的肉質(zhì)性狀間表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，這可能是因品種間遺傳差異所致。陶新等［17］發(fā)現(xiàn)金華豬的c.594C＞G位點(diǎn)基因型結(jié)構(gòu)與3個(gè)外來(lái)豬種（杜洛克、大白豬和長(zhǎng)白豬）存在差異，金華豬在該位點(diǎn)以GG型為優(yōu)勢(shì)基因型，這與本研究結(jié)果一致。此外，楊攀等［18］也發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)兩個(gè)地方品種（大圍子豬和寧鄉(xiāng)豬）與國(guó)外兩個(gè)品種（杜洛克豬和大白豬）在FTO基因第四內(nèi)含子g.276G＞T位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性存在較為明顯的差異。

綜上，槐豬在FTO基因g.-167 T＞G、c.46-139 A＞T和c.594 C＞G等3個(gè)位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性與分子遺傳標(biāo)記功能具有獨(dú)特性，其中，g.-167 T＞G和c.46-139A＞T兩個(gè)SNP可作為槐豬肉質(zhì)性狀選育的潛在分子遺傳標(biāo)記，然而本研究雖然保證了被測(cè)槐豬相同的飼喂條件，由于部分基因型個(gè)體在各自性別中數(shù)量太少，無(wú)法從統(tǒng)計(jì)學(xué)水平剔除性別對(duì)基因型與肉質(zhì)性狀相關(guān)性的影響，因此，本研究結(jié)果仍應(yīng)在更大的群體中作進(jìn)一步驗(yàn)證。

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