3種中藥活性成分對耐多藥鮑曼不動桿菌的體外抑菌作用

陳 佳，江雅琴，李 偉，王艷平

（湖南省湘潭市中心醫院藥學部，湖南 湘潭 411100）

鮑曼不動桿菌為非發酵條件致病菌，廣泛存在于自然環境中，可引起肺炎、尿路感染、傷口感染等。隨著抗菌藥物的廣泛使用，鮑曼不動桿菌（Ab）的耐藥問題也日益突出，衛生部全國細菌耐藥監測（Mohnarin，由全國84家醫院參與）結果顯示，鮑曼不動桿菌的多藥耐藥和泛耐藥菌株比例高達53.8%[1]，其對青霉素類、頭孢菌素類藥物的耐藥率已達63.0% ～89.9%，對氨基苷類、喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率高達88.6%[2]，對曾為治療鮑曼不動桿菌“金牌藥物”的碳青霉烯類耐藥率也超過60%。目前，多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDR－Ab）感染率迅猛上升，成為微生物學、流行病學及臨床藥學共同面臨的難題。近代研究發現，許多中藥如丁香、姜黃、大蒜有良好的廣譜抗菌作用，而關于其主要成分丁香酚、姜黃素、大蒜素的抑菌活性亦有報道[3－5]。由于這3種中藥活性成分完全不同的化學結構和抗菌機制，有可能繞過Ab的耐藥機制而緩解耐藥。為此，本研究中考察了這3種成分體外抑制MDR－Ab活性的效果，以期篩選出有活性的天然化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源：42株 MDR－Ab來自于我院 2016年3月至2017年5月門診及住院患者的各種標本，包括痰液24株，創面分泌物12株，尿液3株，腹腔積液2株，腦脊液1株（1個患者1株）。

儀器：MICroScan WalkAway－40型全自動微生物分析儀（Dade Behring公司）；Spectra MaxM5型酶標儀（Moleacular Devices公司），HF safe操作安全柜，恒溫培養箱，冰箱，干熱滅菌器，試管，移液槍等。

試劑：MH培養基及有關試劑(杭州天和生物技術有限公司)；藥敏紙片(北京天壇藥物生物技術開發公司)；96 孔板（Costar公司）；丁香酚（批號為 Z110725，純度≥98%），大蒜素（批號為 100384，純度≥98%），姜黃素（批號為 ZT－20112，純度≥98%），均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒別及藥物敏感性判斷

使用全自動微生物分析儀鑒定菌種。藥物敏感性試驗，標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922，根據美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS/CLSI）2015年版標準判斷抗菌藥物敏感性。

1.2.2 溶液制備

菌懸液[6]：取上述經鑒定的 MDR－Ab菌株，接種于肉湯中增菌，35℃下培養6 h后，取3 mL菌液通過比濁儀，校正其濁度至0.5 Mac Farland，然后再用MH肉湯稀釋至 1.5×105cfu/mL。

中藥活性成分溶液：分別稱取丁香酚、姜黃素和大蒜素適量，精密稱定，先加入少量二甲基亞砜（DMSO）溶解，再加入水（DMSO含量不超過1%），超聲，定容。

1.2.3 最低抑菌濃度（MIC）測定

參照文獻[7]方法稍作修改，用微量倍比稀釋法測定藥物的 MIC值。丁香酚、姜黃素、大蒜素溶液（初始質量濃度為0.8 mg/mL，1%DMSO）分別用MH肉湯培養基連續倍比稀釋9個質量濃度，添加至無菌96孔細胞培養板中，每孔 100 μL，分別接種等體積 1.5 ×105cfu /mL的菌懸液，并以1%DMSO作為溶劑對照，以亞胺培南作為陽性對照（亞胺培南 MIC由前述分析儀測得），以空白培養基為陰性對照；于37℃恒溫箱中培養24 h后觀察，用酶標儀在600 nm波長下檢測光密度（OD）值，將每孔所得到的 OD值減去空白對照孔的和溶劑對照孔 OD值，再除以生長對照孔與溶劑對照孔 OD值差，即每孔內細菌的生長百分數。以抑制80%細菌生長的最低藥物濃度作為 MIC判讀各化合物的 MIC值。每組質量濃度設置2個復孔，重復操作3次，繪制生長曲線，分別檢測 20株 MDR－Ab，推算 50%最低抑菌濃度（MIC50）和 90% 最低抑菌濃度（MIC90）。

2 結果

2.1 3種成分對MDR－Ab的抑制情況

丁香酚對MDR－Ab抑菌作用最顯著，大蒜素的抑制作用弱于丁香酚，姜黃素抑制作用最弱。詳見表1。

2.2 丁香酚對MDR－Ab生長曲線的影響

選取菌株1、菌株2、菌株3，分別給予質量濃度為32，64，128 μg /mL 的丁香酚干預，每株設置空白對照，以培養時間為橫坐標，600 nm波長處測定的藥物孔 OD值減去空白孔 OD值的均值為縱坐標，繪制MDR－Ab生長曲線。與空白對照相比，在丁香酚作用下，MDR－Ab進入對數生長期的時間點和對數生長期延續時間無明顯改變，但生長受到明顯抑制，無法達到生長高峰。詳見圖1。

表1 中藥活性成分對 MDR－Ab的抑菌活性（μg/mL）

圖1 丁香酚對MDR－Ab生長曲線的影響

3 討論

鑒于鮑曼不動桿菌的多重耐藥性，可選藥物少之又少，如何治療該菌感染成為全球性難題。該菌耐藥機制主要包括：滅活酶或修飾酶（水解β－內酰胺酶及氨基苷類修飾酶）的產生；細胞膜通透性降低，使得孔蛋白修飾減少，抗生素難以進入菌體；藥物作用靶位改變，藥物到達作用靶位量減少；形成生物被膜阻止抗生素接觸菌體，適應了抗生素選擇壓力，進而抵抗抗生素殺菌作用；外排泵高度表達使得多種藥物被排出菌體；耐藥決定簇水平傳播遺傳元件或基因結構的突變使得細胞功能失活及改變修飾[8]。治療該菌感染的一種方法是利用不同抗生素之間的協同或相加作用提高治療藥效，減少耐藥菌株，但對于偶然出現的全耐藥病菌仍然束手無策；另一種方法則是研制新的抗菌藥物，在目前抗生素研發不景氣的情況下，許多研究者把目光轉向從植物中尋找具有抗耐藥菌活性的化合物。研究發現，許多中藥可干擾細菌的酶系、誘導蛋白質凝固及改變細胞膜的通透性，甚至干擾細菌生長及繁殖[9]，阻斷細菌某個組分的合成或抑制細菌外排泵，從而達到抑菌作用[10]。

姜黃素為二酮類色素，是中藥姜黃的主要成分，姜黃素具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及幽門螺桿菌均有抑制作用[11]。大蒜既是常用調味品，同時也具有抗病原微生物活性，其主要有效成分為大蒜素，可顯著抑制表皮葡萄球菌生長[12]。丁香酚是中藥丁香揮發油的主要成分，具有廣譜抗菌活性；近期研究表明，丁香酚可迅速與奇異變形桿菌細胞膜相互作用，改變其滲透性并釋放細胞內成分，從而導致細胞死亡[13]。也有研究表明，丁香酚可以抑制鮑曼不動桿菌附著和入侵人體皮膚，從而抑制其生物膜形成[14]。本研究結果顯示，丁香酚、姜黃素和大蒜素均對MDR－Ab有一定抑制作用，為進一步開發新型植物源抑菌藥物提供了思路。

同時發現，丁香酚對MDR－Ab抑制作用最強，其機制可能是丁香酚作為有機酚類，作用于細菌細胞膜上的脂質和蛋白質[15]，使之發生變性而發揮抗菌作用的。曾有研究發現，大部分抑菌中藥對細菌的生長和蛋白譜的表達有影響[16]。本研究結果也表明，丁香酚可抑制MDR－Ab生長期到達峰值，后期將對丁香酚對MDR－Ab蛋白質表達譜的影響及其具體分子作用機制進一步深入研究。

參考文獻：

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