Meta分析評估肌萎縮側索硬化患者磷酸化神經絲蛋白的臨床診斷價值

楊彥 (湖北中醫藥高等專科學校護理系，湖北 荊州 434020)

胡小輝 (長江大學第二臨床醫學院 荊州市中心醫院神經內科，湖北 荊州 434020)

劉玲華 (湖北中醫藥高等專科學校護理系，湖北 荊州 434020)

肌萎縮側索硬化癥(ALS)是一種運動神經元疾病，患者中位生存時間為2～4年，但是診斷延遲時間可長達8.6～16.8月[1]。診斷延遲的原因與發生率極低和臨床表型變異大有關[2]，而各種各樣的ALS模擬綜合征，如多灶性運動神經病、原發性側索硬化癥、進行性肌萎縮和脊髓小腦共濟失調3型等，使ALS診斷更復雜化[3]。因此，需要尋找ALS的診斷生物標記物，以便提高其診斷準確性。

對于ALS患者，運動神經元軸突的快速退變可能會導致pNfH顯著升高[4]。近年來，有關ALS患者腦脊液(CSF)磷酸化神經絲蛋白重鏈(pNfH)變化的研究逐漸增多，Xu Z等采用Meta分析的方法證明了ALS患者CSF和血液中神經絲蛋白輕鏈(NFL)水平較健康者和非ALS疾病者明顯升高[5]，但是尚未有報道采用Meta分析的方法評估ALS患者CSF pNfH臨床運用價值。因此，我們采用Meta分析的方法估計了CSF pNfH 在診斷ALS中的作用。

1 資料與方法

1.1 搜索策略

根據Cochrane手冊[6]，系統檢索已發表在“PubMed”、“Springer”和“Medline”數據庫，以及列在文章的參考文獻，時間限定為至2017年1月，語言限制為“英語”，關鍵字為“Neurofilament”, “Neurofilament light chain”, “Neurofilament heavy chain” 和 “Amyotrophic lateral sclerosis”。

1.2 納入和排除標準

納入標準：①診斷為ALS的患者。②回顧性或前瞻性病例對照研究設計。③對CSF pNfH水平進行檢測。除此之外，排除標準包括：①非人類的研究、評論、評論、會議、社論和手稿。②病例報告和病例系列，無健康或非ALS疾病組對照。③研究對象為兒童、青少年和孕婦。④不能從原始文獻中提取CSF pNfH平均值和標準差。

1.3 數據提取與質量評價

兩名研究人員評估搜索結果和選定的文章，提取研究數據。對納入報道的方法學質量評估采用紐卡斯爾-渥太華評分(NOS)標準[7]，包括選擇性(0～4分)，可比性(0～2分)，和暴露(0～3分)類，低于6分的報道標為低質量。

1.4 統計學分析

采用Chi-squared (I2) 進行異質性分析。為計算平均標準均差(Std.md)和95%可信區間(CI)，當異質性檢驗P≥0.05時采用固定效應模型，當異質性檢驗P<0.05時采用隨機效應模型。敏感性分析采用亞組分析。漏斗圖評估發表偏倚。繪制HSROC評價CSF pNfH 在診斷ALS中的敏感性和特異性。異質性、合并Std.md、漏斗圖和HSROC模型采用RevMan5.3版(Copenhagen: The Nordic Cochrane Centre, The Cochrane Collaboration, 2014)。并且，采用Meta回歸分析各研究間的異質性來源。Meta回歸采用Comprehensive Meta-Analysis 2軟件 (Biostat, Englewood, NJ)進行計算。

2 結果

2.1 文獻檢索結果及納入研究的一般特點

根據納入標準，刪除重復的報告后，總共檢索到174篇文獻。根據排除標準，提取了7例病例對照研究資料[8～14]。在匯總CSF pNfH在診斷ALS過程中的敏感性和特異性時，提取了7篇病例對照研究[8, 9, 11～13, 15, 16]。

納入本次Meta分析的報道基本特征列于表1。7篇報道[8～14]共匯集了26組數據，有792例參與者，包括500名ALS患者和280例健康或非ALS疾病對照者。ALS患者癥狀出現的平均年齡為64.5歲。此外，ALS患者平均病程為9.6月(7～85.3個月)。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術，如夾心ELISA、SMI35 pNfHAb(Sternberger)和pNfH ELISA Kit(biovendor)，檢測CSF pNfH水平。根據NOS標準[7]，納入的研究方法學評分均大于6分。

此外，CSF pNfH在ALS的診斷過程中的敏感性和特異性數據分別從7項報道[8, 9, 11～13, 15, 16]中提取數據(表2)，并用于繪制HSROC模型。7篇報道中共包括884例參與者，其中有477例ALS患者和407例健康和非ALS疾病對照者。

2.2 ALS患者腦脊液 pNfH水平

在比較ALS 患者CSF pNfH水平與健康和非ALS疾病對照組的差異時匯總了7篇報道，含25個亞組，亞組之間存在明顯的異質性(I2= 88%，P<0.00001)。因此，采用隨機效應模型計算合并Std.MD(圖1)。ALS患者pNfH水平高于健康和非ALS疾病對照組(Pooled Std.MD=1.78，95%可信區間：[1.16，2.40]，P<0.00001)。

2.3 ALS患者腦脊液NFL水平

當比較ALS患者與健康和非ALS疾病對照者CSF NFL水平時，共納入3篇報道共15亞組，亞組之間存在明顯的異質性(I2=81%，P<0.00001)。采用隨機效應模型計算合并Std.MD。ALS患者CSF NFL水平均高于健康和非ALS疾病對照組(Pooled Std.MD=1.84，95%可信區間：[ 1.10，2.58 ]，P<0.00001)。

2.4 敏感性分析

根據人口變異、檢測技術、ALS組和對照組樣本量等進行亞組分析。研究人群來源于中國的報道之間存在低異質性(I2=55%，P=0.14)。采用了夾心ELISA或SMI35 pNfH抗體檢測技術的報道之間存在低異質性(I2=38%，P=0.21)。此外，ALS患者樣本量為6至30(I2=0%，P=0.78)，0至5(I2= 35%，P=0.06)，31至60(I2= 53%，P=0.14)的報道之間存在無或低異質性。并且，包含非ALS疾病對照者的報道之間存在低異質性(I2= 32%，P=0.12)。最后，采用固定效應模型顯示表明ALS患者CSF pNfH水平高于正常健康和非ALS疾病對照組(Pooled Std.MD=1.83，95%可信區間：[ 1.64，2.01 ]，P<0.00001)。

圖1 森林圖顯示肌萎縮側索硬化患者腦脊液磷酸化神經絲重鏈較對照組明顯升高CSF腦脊液

圖2 層次綜合受試者工作特征曲線 (HSROC) 模型評價采用pNfH ELISA kit(Biovendor)、Sandwich ELISA 和 SMI35 pNfH Ab (Sternberger)檢測的磷酸化神經絲重鏈在鑒別肌萎縮側索硬化 和健康者及非肌萎縮側索硬化疾病中的敏感性和特異性

2.5 發表偏倚

在25組數據中，采用漏斗圖視覺評估發表偏倚。漏斗圖中存在不對稱分布，在本Meta分析中存在較高的發表偏倚風險。

2.6 Meta回歸分析影響ALS患者和對照組之間的腦脊液pNfH差異的因素

年齡、ALS患者和對照組樣本量、ALS病程、ALS患者組和對照組之間的CSF NFL水平Std.MD被匯集到Meta回歸模型中。 ALS患者和對照組之間CSF pNfH Hedges’s g與CSF NFL水平變化一致(r=0.784，P=0.003)，和ALS患者(r=0.012，P=0.00033)和對照組(r=0.029，P=0.003)樣本量明顯相關。此外，CSF pNfH Hedges’s g與ALS患者平均年齡(r=0.055，P=0.140)、對照組平均年齡(r=0.030，P=0.355)及ALS患者病程(r=0.019，P=0.157)無關。

2.7 HSROC模型評價CSF pNfH在診斷ALS中的敏感性和特異性

從7篇報道[8, 9, 11～13, 15, 16]中提取了CSF pNfH在診斷ALS中的敏感性和特異性數據，繪制HSROC(圖2)。視覺評估HSROC顯示CSF pNfH在從健康或非ALS疾病對照組中鑒別出ALS患者存在一定的敏感性和特異性。此外，如HSROC所示，用pNfH ELISA試劑盒(Biovendor)的檢測方法在從健康或非ALS疾病對照組中鑒別出ALS的敏感性和特異性高于 Sandwich ELISA 或 SMI35 pNfH Ab (Sternberger)檢測技術。

3 討論

本次Meta分析表明ALS患者CSF pNfH水平高于健康及非ALS疾病對照組。雖然納入的報道間存在明顯的異質性，但是亞組分析和Meta回歸發現了異質性的主要來源。此外，通過Meta回歸首次揭示CSF pNfH與軸索損傷的標記物NFL顯著相關。

亞組分析探討了人口變異、檢測技術、ALS組樣本量對ALS患者CSF pNfH相對于健康及非ALS疾病組水平升高的影響。首先，來源于歐洲的23組數據間存在明顯的異質性，而2組來源于中國的數據間具同質性。因此，人口變異是異質性來源之一。其次，采用夾心ELISA或SMI35 pNfHAb檢測技術探測CSF pNfH水平的研究間具同質性。此外，采用pNfH ELISA Kit技術探測CSF pNfH水平的研究間存在顯著的異質性。因此，CSF pNfH檢測技術可能是異質性來源之一。最后，ALS組樣本量為0～5，6～30，31～60的研究間分別存在無或低異質性，因此ALS組樣本量的大小是異質性的一個來源。此外，由于ALS患者CSF pNfH變化與ALS和對照組樣本量呈明顯正相關，因此健康及非ALS疾病對照組的樣本量大小也被認為是異質性的來源之一。本研究首次報道了人口變異、檢測方法、樣本量是ALS患者CSF pNfH水平與健康或非ALS疾病對照組間差異的主要異質性來源。

pNfH被認為神經系統損傷的生物標志物[4]。Meta回歸分析顯示，在ALS患者CSF中，pNfH的變化趨勢和NFL水平變化一致。軸突中NF蛋白的積累有助于維持神經元損傷后軸突細胞骨架的穩定，同時，NF 碳末端磷酸化在軸突生長中起重要作用[4]。NFL作為NF一個亞基，隨著時間的推移，CSF NFL水平升高與ALS患者疾病泛化和皮質脊髓束變性嚴重程度相關[17]。因此，pNfH作為NF的活性形式，是在神經系統損傷后評估ALS患者的大腦和脊髓軸突損傷病理變化的較為有價值的生物標記物[14]。

雖然Oeckl等的研究發現pNfH與ALS的病程之間存在顯著的負相關[12]，但是Meta回歸顯示ALS病程與ALS患者CSF pNfH水平變化無相關性。原因可能與Oeckl PP等的多中心臨床研究中ALS病程變異范圍較Meta回歸中匯總的ALS患者病程有關：Oeckl PP等的研究中ALS病程為4月至247.4月[12]，而納入本次Meta分析的ALS患者平均病程為7月至85.3月(表1)。在Ganesalingam J等的研究中，CSF pNfH與ALS病程呈負相關[16]，然而，大多數ALS患者病程少于50月，只能反映CSF pNfH與ALS早期病程的關系。此外，在Ganesalingam J等的研究中[16]，CSF pNfH主要在ALS疾病早期增加，在ALS疾病后期升高并不明顯[12, 16]。因此，仍然需要更多樣本的前瞻性研究評估CSF pNfH與ALS病程的關系。

HSROC顯示CSF pNfH在鑒別ALS和非ALS疾病時具有較高的敏感性和特異性(圖2)，并且，采用pNfH ELISA試劑盒(biovendor)區分ALS和非ALS的敏感性和特異性比采用夾心ELISA或SMI35 pNfHAb檢測方法更高。因此，在區分ALS和非ALS疾病時，建議采用pNfH ELISA試劑盒檢測pNfH CSF水平。

當前Meta分析存在一定的局限性。第一，原始研究多為觀察性或橫斷面研究。選擇性偏倚不可避免。第二，雖然人口變異、檢測技術，樣本量是納入文獻的主要異質性來源，但是納入文獻的高度異質性削弱了ALS患者CSF pNfH水平高于非ALS疾病患者的說服力。第三，在匯總分析CSF pNfH水平在ALS患者和健康及非ALS疾病組中的變化時，研究文獻間存在明顯的發表偏倚。發表偏倚可能來源于未發表的陰性結果。第四，不同的中心或實驗室提供的研究樣本量太少(5例)[10,14]。第五，某些研究中ALS患者和對照組之間平均年齡存在顯著差異，并且對照組的疾病譜多樣化，嚴重影響了ALS和對照組的可比性(表1)。第六，ALS的診斷主要依賴于臨床表現和肌電圖結果，采用腰椎穿刺抽取ALS患者腦脊液臨床少見，因此，在評估ALS患者病情過程中，檢測血液pNfH可能會比CSF更實用[11]。

表1 納入文獻的基本特征

注：Con.: 對照組, Se.: 選擇, Co. : 可比性, Ex.: 暴露, ALS: 肌萎縮側索硬化患者, MND: 運動神經元病, MSA: 多系統萎縮, NR: 未涉及, ALS mimic syndrome ALS 模擬綜合征。

表2 采用腦脊液磷酸化神經絲重鏈蛋白水平鑒別肌萎縮側索硬化癥(ALS)

注：. 截止值(Cut-off)單位: ng/mL。

總之，ALS患者CSF中pNfH和NFL水平均高于健康或非ALS疾病對照組。人口變異，pNfH檢測技術，樣本量和ALS患者CSF NFL水平是納入研究間的主要異質性來源。如Meta回歸所示，在ALS患者CSF中，pNfH與NFL相關的軸索損傷和神經退變有關。HSROC模型顯示在鑒別ALS和健康及非ALS疾病中，CSF pNfH水平變化有一定的臨床鑒別價值。

[參考文獻]

[1]Chio A, Logroscino G, Traynor B J, et al. Global epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis: a systematic review of the published literature[J]. Neuroepidemiology,2013, 41:118.

[2] Kiernan M C, Vucic S, Cheah B C, et al. Amyotrophic lateral sclerosis[J]. Lancet,2011, 377:942.

[3] Ghasemi M. Amyotrophic lateral sclerosis mimic syndromes[J]. Iran J Neurol,2016, 15:85～91.

[4] Shea T B and Lee S. Neurofilament phosphorylation regulates axonal transport by an indirect mechanism: a merging of opposing hypotheses[J]. Cytoskeleton (Hoboken),2011, 68:589.

[5] Xu Z, Henderson R D, David M, et al. Neurofilaments as Biomarkers for Amyotrophic Lateral Sclerosis: A Systematic Review and Meta-Analysis[J]. PLoS One,2016, 11:e0164625.

[6] Sterne J, Moher D. Chapter 10:addressing reporting biases.2011.In:Cochrane hand-book for sysematic reviews of intervention version 510(updated march 2011)[Internet][EB/OL]. The Cochrane Collaboration 2011:Available from www.cochrane-handbool.org.

[7] Stang A. Critical evaluation of the Newcastle-Ottawa scale for the assessment of the quality of nonrandomized studies in meta-analyses[J]. Eur J Epidemiol,2010, 25:603.

[8] Brettschneider J, Petzold A, Sussmuth S D, et al. Axonal damage markers in cerebrospinal fluid are increased in ALS[J]. Neurology,2006, 66:852.

[9] Goncalves M, Tillack L, de Carvalho M, et al. Phosphoneurofilament heavy chain and N-glycomics from the cerebrospinal fluid in amyotrophic lateral sclerosis[J]. Clin Chim Acta,2015, 438:342.

[10] Lehnert S, Costa J, de Carvalho M, et al. Multicentre quality control evaluation of different biomarker candidates for amyotrophic lateral sclerosis[J]. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener,2014, 15:344.

[11] Li S, Ren Y, Zhu W, et al. Phosphorylated neurofilament heavy chain levels in paired plasma and CSF of amyotrophic lateral sclerosis[J]. J Neurol Sci,2016, 367:269.

[12] Oeckl P P, Jardel C P P, Salachas F M, et al. Multicenter validation of CSF neurofilaments as diagnostic biomarkers for ALS[J]. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener,2016, 17:404.

[13] Reijn T S, Abdo W F, Schelhaas H J, et al. CSF neurofilament protein analysis in the differential diagnosis of ALS[J]. J Neurol,2009, 256:615.

[14] Steinacker P, Feneberg E, Weishaupt J, et al. Neurofilaments in the diagnosis of motoneuron diseases: a prospective study on 455 patients[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry,2016, 87:12.

[15] Ganesalingam J, An J, Bowser R, et al. pNfH is a promising biomarker for ALS[J]. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener,2013, 14:146.

[16] Ganesalingam J, An J, Shaw C E, et al. Combination of neurofilament heavy chain and complement C3 as CSF biomarkers for ALS[J]. J Neurochem,2011, 117:528.

[17] Tortelli R, Copetti M, Ruggieri M, et al. Cerebrospinal fluid neurofilament light chain levels: marker of progression to generalized amyotrophic lateral sclerosis[J]. Eur J Neurol,2015, 22:215.