不同劑量FTY720對蛛網膜下腔出血大鼠炎癥因子與神經功能的影響

董曉巧，俞文華，杜 權，王 昊，楊定博，沈永鋒，江 力，杜垣峰，朱 強

免疫反應是蛛網膜下腔出血后繼發性腦損傷病理生理機制的重要組成部分[1,2]。FTY720是一種新型的免疫抑制劑，對機體免疫應答具有雙向調節作用，抑制免疫反應的同時并不破壞機體對病毒的免疫應答和免疫記憶能力[3～5]。FTY720已經在臨床上用于治療多發性硬化癥及器官移植后的排斥反應[6,7]。FTY720腹腔注射可以抑制顱腦損傷大鼠中樞神經系統炎癥反應，降低神經細胞凋亡，改善大鼠神經功能[8,9]。FTY720腹腔注射也可以抑制蛛網膜下腔出血大鼠腦炎癥反應，改善大鼠認知功能[10]。迄今，鮮見揭示FTY720神經保護的劑量-藥效關系相關報道。本研究使用不同劑量FTY720腹腔注射治療大鼠蛛網膜下腔出血，觀察其對腦損傷大鼠海馬組織炎癥反應和細胞凋亡及神經功能的影響，探討FTY720神經保護作用的劑量-藥效關系。

1 材料與方法

1.1 材料：健康Wistar大鼠(南京大學模式動物研究所，雄性，清潔級，實驗動物生產許可證SCXK(蘇)2005_0003，使用許可證SYXK(蘇)2005_0004)；Morris水迷宮(型號：XR_XM101，安徽正華生物儀器設備有限公司)；FTY720(規格：25mg，批號：SML0700，美國Sigma公司)；酶標儀(型號：MK3，美國Thermo Scientific公司)；低溫高速離心機(型號：BECKMAN，北京普瑞麥迪實驗室技術有限公司)；熒光分光光度儀(型號：UV_1202，日本島津公司)；腫瘤壞死因子_α酶聯免疫吸附試劑盒(批號：MTA00B，美國R&D公司)，白介素_1β酶聯免疫吸附試劑盒(批號：M6000B，美國R&D公司)，白介素_6酶聯免疫吸附試劑盒(批號：MLB00C，美國R&D公司)。

1.2 方法：將48只大鼠隨機分成假手術組、模型組、小劑量組和大劑量組，每組12只。大鼠予50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，采用Roux等[11]建立的枕大池二次注血法制作蛛網膜下腔出血大鼠模型。假手術組和模型組大鼠予以1ml 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，小劑量組和大劑量組大鼠模型形成前0.5h分別予以FTY720 1mg/kg和5mg/kg劑量腹腔注射。24h后，取各組6只大鼠以80mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離海馬組織，用于炎癥和細胞凋亡相關指標的測定；各組其余6只大鼠用于神經功能的評估。大鼠模型形成后，假手術組大鼠死亡1只，模型組大鼠死亡3只，小劑量組大鼠死亡2只，大劑量組大鼠死亡1只。大鼠死亡后補充成活大鼠，保證每組12只大鼠。經卡方檢驗，四組大鼠死亡率差異無統計學意義(χ2=1.80，P>0.05)。

1.3 海馬組織炎癥和細胞凋亡相關指標測定：取部分海馬組織制作勻漿，離心后采用酶聯免疫吸附法測定上清液腫瘤壞死因子_α、白介素_1β和白介素_6水平：將標準品和待測樣本各50μl依次加入孔中，并做好標記；37℃溫育30min后，棄去孔內液體，洗板5次；在各孔中分別加入50μl酶標試劑，37℃溫育30min后，棄去孔內液體，洗板5次；在各孔中分別加入100μL顯色試劑，37℃避光孵育10min后，每孔加終止液50μL，充分混勻，終止反應；用酶標儀在450nm測定OD值，結果表示為pg/mg腦組織。取部分海馬組織制作勻漿，采用四肽熒光底物法檢測caspase_3和caspase_9蛋白活性。取100μl腦組織勻漿和10μl caspase_3或caspase_9底物，加入緩沖液至1ml，37℃孵育1h。用熒光分光光度計在激發波長380nm或400nm，釋放波長460nm或505nm處測定樣本熒光強度，以未加腦組織時的熒光強度為參照值，計算熒光強度，最終比較相對熒光強度，間接反應caspase_3和caspase_9蛋白活性。

1.4 大鼠神經功能評價：參照Vorhees等[12]的方法，在腦損傷后第8、9、10、11和12天對大鼠進行Morris水迷宮定位航行實驗，記錄大鼠逃避潛伏期，用于反映大鼠的學習能力，從而評價大鼠的認知功能。將大鼠面向池壁分別從兩個象限的入水點放入水中，記錄其在120s內尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。如果大鼠120s內不能找到平臺，則由實驗者用手牽引其到平臺上停留10s，再放回到籠中，記錄時間120s。Chen等[13]的方法，在腦損傷后第14、15、16、17和18天測定大鼠改良神經功能缺損程度評分，包括運動、感覺、反射和平衡試驗，最低分為0，最高分為18分，分值越高神經功能損傷越嚴重。

2 結果

2.1 FTY720對大鼠認知功能的影響：在蛛網膜下腔出血后第8、9、10、11和12各個時間點，四組大鼠逃避潛伏期組間比較差異均有統計學意義(均P<0.01)；且組間兩兩比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。采用重復測量方差分析，考慮腦損傷后5個時間點，四組大鼠逃避潛伏期組間比較差異有統計學意義(F=308.86，P<0.01)，且模型組逃避潛伏期顯著長于假手術組(P<0.05)，小劑量組逃避潛伏期較模型組顯著縮短(P<0.05)，大劑量組逃避潛伏期較小劑量組顯著縮短(P<0.05)，見表1。

表1 FTY720對大鼠蛛網膜下腔出血后逃避潛伏期的影響

2.2 FTY720對大鼠改良神經功能缺損程度評分的影響：假手術組大鼠改良神經功能缺損程度評分均為最低分，即為0分。在蛛網膜下腔出血后第14、15、16、17和18各個時間點，模型組、小劑量組和大劑量組三組大鼠改良神經功能缺損程度評分組間比較差異均有統計學意義(均P<0.01)；且組間兩兩比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。采用重復測量方差分析，考慮腦損傷后5個時間點，三組大鼠改良神經功能缺損程度評分組間比較差異有統計學意義(F=74.32，P<0.01)，且小劑量組大鼠改良神經功能缺損程度評分較模型組顯著降低(P<0.05)，大劑量組大鼠改良神經功能缺損程度評分較小劑量組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 FTY720對大鼠改良神經功能缺損程度評分的影響

2.3 FTY720對大鼠海馬組織炎性因子水平及凋亡相關蛋白活性的影響：四組大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6水平及caspase_3和caspase_9蛋白活性組間比較差異均有統計學意義(均P<0.01)，且模型組較假手術組大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6水平及caspase_3和caspase_9蛋白活性均顯著升高(均P<0.05)，小劑量組較模型組大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6水平及caspase_3和caspase_9蛋白活性均顯著降低(均P<0.05)，大劑量組較小劑量組大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6水平及caspase_3和caspase_9蛋白活性均顯著降低(均P<0.05)，見表3。

表3 FTY720對大鼠海馬組織炎性因子水平及凋亡相關蛋白活性的影響

3 討論

蛛網膜下腔出血是一種重要的腦損傷形式，可引發腦血管痙攣、腦缺血和神經功能障礙，甚至造成患者死亡[14,15]。腦動脈瘤破裂是蛛網膜下腔出血的主要原因，目前的醫療手段可有效地處理絕大部分腦動脈瘤，但對蛛網膜下腔出血造成的早期腦損傷卻缺乏有效的治療方法。免疫反應參與蛛網膜下腔出血后繼發性腦損傷過程[1,2]，抑制免疫反應對減少繼發性腦損傷有著重要的作用。但臨床常規使用的免疫抑制劑可導致全身免疫功能低下，繼發感染。因此尋找一種安全有效的免疫抑制劑對于降低蛛網膜下腔出血后腦損傷有著重要意義。

FTY720由冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的ISP_I進行結構改造而成的，屬于鞘氨醇_1_磷酸鹽受體阻滯劑。FTY720作為一種新型的免疫抑制劑，在體外以無活性的形式存在，在體內需經鞘氨醇激酶2磷酸化而轉化為具有生物活性的FY720異構體而發揮作用[3～5]。目前，FTY720在臨床上主要用于治療肝腎器官移植后的排斥反應及皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂/障礙疾病[6,7]。

FTY720用于腦損傷治療方面的實驗研究發展很快。FTY720可有效地阻止體外培養膠質細胞釋放炎性因子[16]，顯著抑制顱腦損傷大鼠腦皮層炎性細胞聚集和炎癥因子釋放[17]，明顯抑制動物腦出血后腦內淋巴細胞浸潤[18]。本研究發現，FTY720可以有效抑制蛛網膜下腔出血大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6的分泌。這些數據說明，FTY720可有效地抑制蛛網膜下腔出血繼發的中樞神經系統炎癥反應。

動物實驗證實，FTY720可顯著降低顱腦損傷大鼠海馬組織caspase_3和caspase_9蛋白活性，抑制顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡，提高腦損傷大鼠的肢體運動功能和認知功能[8,9]；FTY720也可改善短暫性腦缺血和腦出血大鼠肢體運動功能[19,20]。本研究證實，FTY720可顯著抑制蛛網膜下腔出血大鼠海馬組織caspase_3和caspase_9蛋白活性，縮短逃避潛伏期，改善大鼠的認知功能，提高改良神經功能缺損程度評分，改善神經功能缺損。這些研究結果提示，FTY720可有效地抑制神經細胞凋亡，改善蛛網膜下腔出血大鼠神經功能。

既往的絕大部分動物實驗均使用1mg/kg FTY720腹腔注射用于治療腦出血、腦缺血、腦外傷和蛛網膜下腔出血[8～10,19,20]。但少有研究揭示FTY720治療腦損傷的劑量和藥效關系。本研究選擇了FTY720 1mg/kg和5mg/kg兩種劑量腹腔注射用于治療大鼠蛛網膜下腔出血。本研究結果顯示，FTY720腹腔注射可劑量依賴性地抑制大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6釋放及caspase_3和caspase_9蛋白活性，同時明顯改善蛛網膜下腔出血大鼠的認知功能和神經功能缺損。這些現象說明，FTY720對恢復神經細胞結構和功能具有重要作用。由于FTY720本身具有免疫功能抑制作用，而抑制炎癥反應降低神經細胞凋亡與改善神經功能具有必然的聯系[21～23]。因此，FTY720改善蛛網膜下腔出血大鼠神經功能可能與其抑制中樞神經系統炎癥反應及降低神經細胞凋亡有關，而且這種效應呈現劑量依賴性。FTY720對腦損傷作用的更多著落點并非其作用于免疫系統，而是穩定地穿過血腦屏障，直接作用于中樞神經系統內的1_磷酸鞘氨醇受體，能通過上調神經營養因子表達、下調凋亡基因表達、受體激活或功能性內化等方式對中樞內神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞、微血管產生生物調節作用[24,25]。因此，在解釋FTY720對腦損傷保護的機制方面需要保持謹慎態度。

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