PTEN介導的自噬對慢性酒精刺激引起的心肌損害的保護作用

高學忠，黃隱青，林 叢，黃亦煒，張 鑫，吳連拼

長期大量飲酒，攝入體內的酒精及其代謝產生毒性更為巨大的乙醛等對心臟產生毒害作用，使心肌代謝和組織學異常，導致心肌變形、心臟擴大、心肌收縮力降低，心功能下降，臨床上稱之為酒精性心肌病(alcohol cardiomyopathy，ACM)[1]。隨著現代飲酒人數的逐漸增多，飲酒量的加大，ACM的發病率也逐年上漲[2]。酒精對心臟的損害已成為威脅人類健康的世界性問題，越來越受到關注，但ACM的發病機制目前尚不十分清楚。

自噬(autophagy)是將機體內受損、變性或衰老的蛋白質以及細胞器運輸到溶酶體內進行消化降解的動態過程，是維持機體內環境穩態的重要調節機制[3]。正常水平的自噬對心臟的結構和功能發揮著至關重要的作用。但自噬過度和自噬不足卻可能導致疾病的發生。此外，大量文獻表明自噬在多種心血管疾病中都扮演著重要的作用，如心肌缺血、再灌注、心肌肥大、糖尿病心肌病等均可誘導心肌內自噬水平增強[4，5]。因此自噬在不同的病理條件下，扮演著不同的角色，需要進一步的研究確認。而在慢性酒精心肌病的發生和發展過程中，自噬的研究卻很少涉及。本研究通過建立小鼠酒精心肌病模型，觀察心肌自噬的變化，旨在探討自噬對酒精心肌病的作用以及人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)介導的自噬的發生機制。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器：40只雄性C57BL/6小鼠，12周齡(溫州醫科大學實驗動物中心)；酒精飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；TUNEL試劑盒購自Roche公司。3_Methyladenine和SF1670試劑購自Sigma_Aldrich公司；PTEN抗體、LC3A/B抗體、p_mTOR抗體、mTOR抗體、β_actin抗體購自Abcam公司；AKT抗體、p_AKT抗體、p_s6抗體、s6抗體、cleaved Caspase_3抗體購自CST公司；熒光二抗驢抗兔IgG購自Invitrogen公司；激光共聚焦顯微鏡(日本Niko公司)；Vevo7701型超聲心動儀(加拿大公司)。

1.2 方法：

1.2.1 小鼠分組：40只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為四組，分別為對照組(Con)、慢性酒精心肌病組(EtOH)、慢性酒精心肌病+3_MA組及慢性酒精心肌病+PTEN抑制劑(SF1670)組，每組各10只。

1.2.2 小鼠慢性酒精心肌病模型的構建：對小鼠進行連續8周的含有4%(vol/vol)酒精飼料喂養[6]。對照小鼠用普通等量飼料喂養。連續喂養8周后進行超聲心動圖檢測。

1.2.3 小鼠心臟功能檢測：對照小鼠和給藥小鼠，按照60mg/kg的比例，腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉麻醉。應用高分辨的彩色多普勒超聲心動圖分析小鼠心功能(Vevo 7701；Canada)。檢測射血分數(ejection fraction，EF)、短軸縮短率(fractional shortening，FS)，以上數值均連續檢測5個心動周期，計算平均值。

1.2.4 心肌細胞凋亡檢測：采用TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡情況[9]。

1.2.5 提取心肌總蛋白：各心臟樣品取出后，置于研缽中，加入液氮，在低溫下迅速碾磨至粉末狀，加一定量的組織總蛋白提取裂解液，4℃靜置3h，置于超聲細胞破碎儀中破碎細胞，15000rpm，4℃，15min離心，提取上清。

1.2.6 心臟LC3_II免疫熒光檢測：各組小鼠心臟于4%的多聚甲醛固定24小時，置于20%的蔗糖脫水24小時，30%的蔗糖脫水24小時。用OCT包埋，包埋塊固定于冰凍切片機上，調整切片厚度，6μm切片，制片。用LC3_II抗體4℃孵育過夜，然后用熒光二抗37℃孵育2小時，于共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 Western blot提取各組心肌組織蛋白，BCA蛋白定量后，對樣品進行電泳，轉膜和化學發光，條帶掃描后應用Quantity one軟件半定量分析蛋白條帶的灰度值，相對表達量以各蛋白條帶與對應β_actin條帶灰度計算比值，評估目的蛋白的表達變化。

2 結果

2.1 慢性酒精刺激會促進C57BL/6小鼠心肌自噬的發生，誘導心肌凋亡：小鼠用酒精飼料連續喂養8周后，然后通過免疫印跡方法檢測心肌細胞中自噬相關蛋白LC3_II的表達水平。和對照組小鼠相比，酒精刺激能夠顯著上調LC3_II的蛋白表達量(圖1A，1B)。我們進一步使用免疫熒光染色方法對自噬進行檢測，LC3_II的紅色熒光斑點的積累也表明了酒精刺激能夠促進小鼠心肌自噬的發生(圖1D，1E)。此外，與對照小鼠相比，酒精組心肌內的凋亡相關蛋白cleaved caspase_3(c_CAS_3)的表達量也有顯著的增加，說明酒精刺激能夠誘發心肌細胞凋亡。

2.2 自噬的激活緩解酒精刺激引起的心功能下降和細胞凋亡：酒精刺激能夠誘導自噬的激活，但自噬在不同疾病中發揮著不同的作用。為了確定自噬的激活在酒精性心肌病中的作用，我們利用自噬的抑制劑3_MA，按照10mg/kg劑量，每周腹腔注射一次。結果可以發現，酒精組小鼠心功能有所下降，同時射血分數和縮短分數都有所下調，而當共同作用3_MA和酒精的小鼠，心功能損傷的更為明顯，EF、FS進一步下降(圖2A_C)。酒精刺激能夠誘導c_CAS_3蛋白的表達量增加，共同作用3_MA和酒精的小鼠，c_CAS_3的蛋白表達量也進一步的上調，表明細胞凋亡增加(圖2D，2E)。由此說明酒精刺激誘導的自噬激活對酒精性心肌病具有保護作用。

圖1 慢性酒精刺激誘導心肌自噬發生，促進細胞凋亡 注：A：Western blot的檢測小鼠心肌組織LC3_II、c_CAS_3蛋白表達水平；B：LC3_II的表達量；C：c_CAS_3的表達量；D：免疫熒光檢測自噬的發生；E：LC3陽性細胞的數量。與Con比較*P<0.01

圖2 自噬在酒精引起的心功能紊亂中起到保護作用 注：A：各組小鼠的心功能示意圖；B各組小鼠心臟射血分數；C：各組小鼠心臟縮短分數；D：Western blot的檢測小鼠心肌組織c_CAS_3蛋白表達水平；E：c_CAS的表達量。與Con比較*P<0.05，**P<0.01；與EtOH比較#P<0.05

2.3 慢性酒精刺激上調PTEN蛋白的表達量：免疫印跡技術表明在慢性酒精刺激下，小鼠心臟內的PTEN蛋白表達水平有明顯地增加(圖3A，3B)，PTEN表達的增加對AKT/mTOR有著進一步的負調控作用，AKT和mTOR的磷酸化水平下降(圖3A，3C，3D)，s6是mTOR的下游，其磷酸化水平也有顯著下降(圖3E)。

圖3 慢性酒精刺激引起小鼠心臟內PTEN蛋白表達量上調 注：A：Western blot的檢測小鼠心肌組織PTEN、p_AKT/AKT、p_mTOR/mTOR、p_s6/s6以及β_actin蛋白表達水平；B：PTEN的表達量；C：p_AKT/AKT的比值；D：p_mTOR/mTOR的比值；E：p_s6/s6的比值。與Con比較*P<0.01

2.4 慢性酒精刺激誘導的自噬上調主要由PTEN調控：為了探究PTEN在酒精誘導的自噬中的作用，我們利用PTEN的抑制劑SF1670，按照3mg/kg，每周皮下注射3次，8周后檢測自噬的變化。與單純作用酒精小鼠相比，共同作用酒精和SF1670的小鼠心肌內PTEN的表達量下調至正常水平，同時AKT、mTOR、s6的磷酸化水平也回升了。進一步檢測自噬相關蛋白LC3_II的表達量，作用SF1670可以顯著下調酒精刺激誘導的LC3_II表達量的增加，抑制自噬的發生。由此說明PTEN在酒精刺激誘導的自噬中發揮著重要的調控作用。

2.5 PTEN的抑制進一步加劇心肌細胞凋亡：為了證明PTEN活性對酒精引起的心臟功能損傷和心肌細胞凋亡具有作用，我們研究了SE1670在酒精刺激的小鼠心肌中的作用。通過檢測c_CAS_3蛋白表達水平(圖5A，5B)、TUNEL實驗(圖5C)得到結果，發現SF1670在抑制自噬激活情況下，明顯加劇了酒精引起心肌細胞的凋亡。

圖4 PTEN介導酒精刺激誘導的自噬 注：A：Western blot的檢測小鼠心肌組織PTEN、p_AKT/AKT、p_mTOR/mTOR、p_s6/s6蛋白表達水平；B：PTEN的表達量；C：p_AKT/AKT的比值；D：p_mTOR/mTOR的比值；E：p_s6/s6的比值；F：Western blot的檢測小鼠心肌組織LC3_II；G：LC3_II的表達量。與Con比較*P<0.01；與EtOH比較#P<0.01

圖5 PTEN的上調在酒精引起的細胞凋亡中起到保護作用 注：A：Western blot的檢測小鼠心肌組織c_CAS_3；B：c_CAS_3的表達量；C：TUNEL檢測細胞凋亡；D：TUNEL陽性細胞的數量。與Con比較*P<0.01；與EtOH比較#P<0.01

3 討論

慢性酒精性心肌病發病率、死亡率逐年增高，已經成為21世紀嚴重威脅人類健康的疾病。酒精性心肌病的發病機制可能包括細胞壞死和凋亡、細胞器損傷、心肌收縮蛋白功能變化、鈣穩態失衡、氧化應激以及神經內分泌系統紊亂等，但是確切機制尚無定論[7]。本研究采用酒精飼料喂養，使小鼠對酒精產生依賴，飼養8周后心臟超聲顯示小鼠心腔普遍擴大，心室壁變薄，心臟的收縮功能明顯降低，小鼠心臟EF、FS都有顯著的降低，說明慢性酒精刺激造成了心臟結構及功能受損。

心肌自噬是在生理和病理條件下普遍存在的生命現象，在心臟疾病的發生發展中具有雙重作用，自噬在心血管應激和心臟疾病中都扮演著重要角色。然而，自噬在慢性酒精引起的心肌功能失調和心肌細胞凋亡中的確切作用仍是不清楚的。本研究證實了，3_MA抑制自噬都會加劇酒精引起的心臟功能失調和心肌細胞凋亡。

自噬的發生在不同病理條件下受到不同的信號通路影響而發揮不同的作用。研究指出，mTOR在自噬通路中起重要的調控作用。在營養、能量充足的情況下，mTORC1能使ULK1(自噬相關基因1同系物)的757絲氨酸位點磷酸化，抑制ULK1的活性，從而抑制AMPK和ULK1的作用，抑制自噬的發生[8]。另外，mTOR上游PI3K/AKT在心臟疾病中也發揮著重要角色，小鼠擴張型心肌病的模型中發現，運動可延長患有擴張型心肌病小鼠的壽命，主要原因是由于心肌PI3K被激活，自噬抑制所致。相反，心肌中PI3K的活性降低，誘導自噬的發生會明顯加速心衰的進程，說明PI3K對維持心臟的結構和功能起重要作用[9]。PTEN是脂質磷酸酶，可通過特異性地促使PIP3的脫磷酸化，使之轉化為PIP2，致使PIP3不能激活下游的AKT，從而抑制AKT的活性。相關文獻也報道，PTEN可通過對PI3K/AKT/mTOR的抑制對自噬進行調控[9，10]。小鼠實驗表明，在酒精刺激下，心肌內的PTEN蛋白表達量明顯上調，與此同時，AKT/mTOR/s6的磷酸化水平下調，當作用PTEN抑制劑SF1670后，情況出現反轉，同時LC3_II的表達量也下調，抑制自噬，進一步增加細胞凋亡。

綜上所述，我們的研究證明了慢性酒精刺激激活自噬發生，對慢性酒精刺激引起的心臟毒性起到一定的保護作用，自噬的激活主要通過PTEN來調控的，有可能在今后為慢性酒精心肌病患者的治療提供一種新的思路。

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