基于ATR-FTIR成像技術的川貝母粉末顯微光譜鑒定△

王月，劉傲雪，張久旭，李小陽，陳建波，王晶娟*

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 100029)

貝母是百合科貝母屬多種植物的藥用鱗莖的統稱。其中，川貝母具有清熱潤肺、化痰止咳功效，用于治療肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽等癥[1]。《中華人民共和國藥典》2015年版收錄的貝母類藥材包括川貝母、伊貝母、平貝母、浙貝母和湖北貝母等品種[2]。其中，川貝母(按性狀不同分別習稱松貝、青貝、爐貝等)的藥效最好，但是資源稀少，因此其價格遠高于另外幾種貝母。市場上的川貝母經常以粉末形式進行銷售，而粉碎后的川貝母與其他貝母很難區分。為了保證市售川貝母粉末的真實性和有效性，必需建立準確快速的真偽鑒別方法，從而能夠及時發現用其他貝母粉末冒充川貝母粉末的造假行為。

《中華人民共和國藥典》2015年版規定的可以用于川貝母粉末鑒別的方法主要有顯微鑒定法、薄層色譜鑒定法與DNA鑒定法[2-3]。薄層色譜鑒定法使用的對照品貝母素乙在其他一些貝母中也存在，不能作為真偽鑒別的必要條件;DNA鑒定法需要相對復雜的樣品處理和較長的測試時間，不適合作為快速鑒別方法;因此，顯微鑒定法是川貝母粉末快速鑒別的主要方法。然而，不同品種的貝母粉末中一般都具有淀粉粒、表皮細胞和導管等結構，而且形態相似、難以區分。因此，顯微鑒定法對操作者的能力和經驗要求較高，所得結果容易受到主觀因素的影響。

顯微光譜鑒定法是傳統顯微鑒定法與光譜鑒定法相結合的產物[4-6]。如果樣品中的細胞、內含物等微觀結構的物理形態難以描述或者區分，可以通過顯微測量技術獲得這些微觀結構的顯微光譜。細胞、內含物等微觀結構的顯微光譜可以反映其化學成分的組成種類和相對含量，而受到物理形態的影響較小。當微觀結構的物理形態復雜多變時，使用顯微光譜可以獲得穩定的化學特征信號；當微觀結構的物理形態不易區分時，使用顯微光譜可以發現化學組成的差異特征。顯微光譜鑒定法不僅保留了傳統顯微鑒定法簡便、快速的優勢，而且能夠建立更加客觀、量化的判別準則。因此，本研究嘗試使用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)成像技術，建立一種簡便快速、客觀量化的川貝母粉末顯微光譜鑒定法。

1 材料

本研究所用18個貝母樣品收集于多個產地和市場，包括3個松貝、3個青貝、3個爐貝、3個伊貝母、3個平貝母和3個浙貝母。各種貝母樣品信息見表1。所有樣品均由北京中醫藥大學中藥學院王晶娟副教授進行性狀鑒定。貝母樣品粉碎后過60目篩，取細粉直接進行光譜測試。可溶性淀粉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

表1 各種貝母飲片樣品來源信息

2 方法

2.1 常規紅外光譜

常規紅外光譜測量所用儀器為PerkinElmer Frontier FT-IR/NIR光譜儀。使用溴化鉀壓片法獲得樣品粉末的紅外光譜，光譜范圍為4000～400 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，每張光譜累加掃描16次，使用空氣作為光譜背景，掃描過程中自動扣除水蒸氣和二氧化碳干擾。所得光譜經過PerkinElmer Spectrum v10軟件的自動基線校正和歸一化處理后用于譜圖分析。

2.2 顯微紅外光譜

顯微紅外光譜測量使用上述Frontier FT-IR/NIR光譜儀與PerkinElmer Spotlight 400 FT-IR Microscope所組成的紅外光譜成像系統以及配套的ATR光譜成像附件進行。將適量樣品粉末放在不銹鋼底板上進行ATR成像測試，測量區域為400 μm×400 μm，像素尺寸為6.25 μm×6.25 μm，光譜范圍為4000～750 cm-1，光譜分辨率為8 cm-1，每張光譜累加掃描8次，使用空白不銹鋼底板作為光譜背景。使用PerkinElmer SpectrumIMAGE v1.7軟件對所得顯微光譜進行自動ATR校正和空氣背景校正，然后以2100～2000 cm-1區域為參考波段進行基線平移校正。顯微光譜的主成分分析使用SpectrumIMAGE軟件進行，相對峰強度計算使用MATLAB v7.0軟件和自編程序進行。

3 結果與討論

3.1 貝母粉末的常規紅外光譜特征

圖1所示為不同品種貝母粉末的常規紅外光譜。貝母鱗莖中含有大量淀粉，所以各種貝母粉末的紅外光譜整體特征都與淀粉非常相似[7]。貝母粉末紅外光譜中1200～400 cm-1區域的一系列吸收峰主要來自于淀粉的C-C伸縮振動、C-O伸縮振動和糖環骨架振動吸收峰。不同品種貝母粉末紅外光譜的主要差異在于1700～1500 cm-1區域。在松貝、青貝和爐貝這3種川貝母中，1650 cm-1附近吸收峰低于1460 cm-1附近吸收峰；在伊貝母、平貝母和浙貝母中，1650 cm-1附近吸收峰高于1460 cm-1附近吸收峰。另外，伊貝母、平貝母和浙貝母中1515 cm-1附近的吸收峰也相對明顯。1800～1200 cm-1區域的吸收峰是多種成分吸收信號的疊加結果，因此僅根據常規紅外光譜難以深入解釋川貝母和其他貝母的上述光譜特征差異的產生原因與可靠性。

圖1 不同品種貝母粉末的常規紅外光譜

3.2 貝母粉末的顯微紅外光譜特征定性分析

圖2所示為根據不同品種貝母粉末的顯微紅外光譜前3個主成分得分而生成的贗彩色圖像。具有相似光譜特征的像素在不同主成分上的得分接近，因而在贗彩色圖像上具有相似的顏色。從圖2可以看出，各類貝母粉末中至少存在三類具有獨特光譜特征的像素，而圖3則顯示了各類像素中的代表性光譜(其空間位置標注在圖2中)。

第一類像素在第一主成分上得分較高，因而在各類貝母的顯微紅外光譜主成分得分圖像中顯示為紅色，其數量占據絕對優勢。從圖3看出，該類像素的光譜特征與淀粉一致，說明該類像素主要對應于貝母粉末中的淀粉粒。第二類像素在第二主成分上得分較高，因而顯示為藍色。該類像素的光譜特征主要是1640 cm-1和1530 cm-1附近的蛋白質酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶吸收峰，說明其可能對應于貝母粉末中的糊粉粒等富含蛋白質的微觀結構。第三類像素在第三主成分上得分較高，因而顯示為綠色。該類像素的光譜中包含1735 cm-1附近的C=O伸縮振動吸收峰、1200～900 cm-1區域的C-C伸縮振動、C-O伸縮振動和糖環骨架振動吸收峰，這些特征峰可能來自構成細胞壁的纖維素、半纖維素和木質素類成分。因此，第三類像素可能對應于貝母粉末中的導管和表皮細胞等。

從圖2看出，伊貝母、平貝母和浙貝母中的第二類和第三類像素明顯多于松貝、青貝和爐貝。第二類和第三類像素在1700～1500 cm-1區域的吸收峰較強，這與常規紅外光譜上伊貝母、平貝母和浙貝母在1700～1500 cm-1區域的吸收峰較強是一致的。顯微紅外光譜分析結果說明，伊貝母、平貝母和浙貝母中蛋白質和細胞壁的含量相對高于川貝母。

3.3 貝母粉末的顯微紅外光譜特征定量分析

如上所述，主成分得分圖像與典型像素光譜初步顯示了第二類和第三類像素的數量是區分川貝母與其他貝母粉末的重要指標。根據圖3可知，第一類像素的主要吸收峰在1200～900 cm-1區域，而第二類和第三類像素在1700～1500 cm-1區域的吸收峰明顯強于第一類像素。因此，根據這兩個區域的吸收峰相對強度，可以對第二類和第三類像素的數量進行評價，從而可以建立區分川貝母與其他貝母粉末的量化判斷指標。本研究定義目標吸收峰A與參比吸收峰B的歸一化相對峰強度R(A/B)按公式(1)計算。

注：S-1～S-3.松貝母3個主成分；Y-1～Y-3.伊貝母3個主成分；P-1～P-3.平貝母3個主成分；Z-1～Z-3.浙貝母3個主成分。圖2 不同品種貝母粉末的顯微紅外光譜主成分得分圖像

注：譜圖編號對應于圖2中像素編號(+)。圖3 不同品種貝母粉末的典型像素顯微紅外光譜

(1)

式中A和B可以是峰高度，也可以是峰面積。

一般文獻中計算光譜相對峰強度的方式為目標峰與參比峰的高度或者面積直接相除。該方法的問題在于，如果某個樣品光譜中作為參比的吸收峰非常弱，可能會產生異常大的相對峰強度值，對統計分析結果造成干擾。使用公式(1)的定義方法，如果A遠遠大于B，相對峰強度接近于1；如果B遠遠大于A，相對峰強度接近于-1。因此，使用這種方法計算的相對峰強度值限制在[-1，1]區間內，不會因為產生異常大的相對峰強度值而對統計分析結果造成干擾。

本研究中使用1700～1500 cm-1區域的吸收峰面積作為參比峰強度，1200～900 cm-1區域的吸收峰面積作為目標峰強度，根據公式(1)計算每個樣品ATR光譜成像中所有像素光譜(4096像素/樣品)的平均歸一化相對峰強度(Rm)，結果如圖4所示。在所有川貝母粉末樣品中，Rm值穩定在0.70左右；在伊貝母、平貝母和浙貝母中，Rm值顯著小于0.70；純淀粉中Rm值約為0.98。也就是說，川貝母粉末中對應于淀粉粒的第一類像素數量顯著高于其他貝母粉末，但是明顯低于純淀粉。Rm值可以作為顯微紅外光譜鑒定法區分川貝母和其他貝母粉末的定量判斷指標。

注：1～3.松貝；4～6.青貝；7～9.爐貝；10～12.伊貝母；13～15.平貝母；16～18.浙貝母。圖4 不同品種貝母粉末的顯微紅外光譜特征峰相對強度

4 結論

綜上所述，本研究利用ATR-FTIR成像技術初步建立了可以有效區分川貝母和其他貝母粉末的顯微紅外光譜鑒定法，并且提出了基于歸一化相對峰強度的量化判斷指標建立方法。但是，本研究中只是使用了最為常見的伊貝母、平貝母和浙貝母作為其他貝母樣品。為了進一步考察本研究提出的顯微紅外光譜鑒定法與量化判斷指標的耐用性，以后還需要繼續收集更多種類的貝母樣品進行方法驗證和完善。

本研究提出的貝母粉末顯微紅外光譜鑒定法也可以為建立其他中藥顯微光譜鑒定法提供參考。顯微光譜鑒定法既有傳統顯微鑒定法簡便快速的優勢，又能夠建立客觀量化的判別規則，對于快速準確的中藥鑒定和質量控制具有重要意義。

[1] 張貴君.精編中草藥[M].北京：中國醫藥科技出版社,2016：88.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：36，97，141，292，348.

[3] 張文娟，尚柯，魏鋒，等.聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性方法對太白貝母鑒別檢驗的適用性探討[J].中國現代中藥，2015，17(9)：905-910.

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