中藥材中有機(jī)磷農(nóng)藥熒光試紙條的開(kāi)發(fā)△

秦斌，王炳志，閆研，馬紅圳，楊星星，殷果*

(1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東 深圳 518057；2.深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東 深圳 518101；)

中藥是中華民族寶貴的文化遺產(chǎn)，在人民群眾防治疾病、康復(fù)保健方面起著重要作用。為了獲得可觀的產(chǎn)量以及較高的經(jīng)濟(jì)效益，中藥材在種植過(guò)程中經(jīng)常會(huì)過(guò)量或不當(dāng)使用農(nóng)藥，而大部分農(nóng)藥在后續(xù)加工處理中難以完全去除[1]。過(guò)量的農(nóng)藥殘留不僅影響中藥產(chǎn)品的質(zhì)量，降低藥材療效，長(zhǎng)期食用更可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至誘發(fā)癌癥[2-4]。目前農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法主要有氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)等，依托相應(yīng)的前處理方法能夠獲得較高的靈敏度[5-7]。上述方法所涉及儀器設(shè)備成本高，操作復(fù)雜，需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作并且不能即刻獲得結(jié)果，因此限制了其在商檢等現(xiàn)場(chǎng)快檢中的應(yīng)用。為了滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求，本研究將熒光納米顆粒進(jìn)行表面修飾，并與有機(jī)磷的特異性抗體進(jìn)行偶聯(lián)，研制了有機(jī)磷納米熒光免疫層析快速檢測(cè)試紙條。與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)相比，該熒光試紙條除操作簡(jiǎn)單快速和信號(hào)穩(wěn)定外，具有強(qiáng)抗光漂白能力，并且受溶劑影響小[8-11]，適用于有機(jī)磷等水溶性較差的目標(biāo)物的快速檢測(cè)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

便攜式熒光檢測(cè)儀由廣州市疾病預(yù)防控制中心和深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司共同研制。

1.2 試劑及材料

對(duì)硫磷、蠅毒磷、豐索磷等農(nóng)藥標(biāo)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；2(CdCl2)·5(H2O)、硼氫化鈉、碲粉、TGA(疏基乙酸)、MES(2-嗎啉乙磺酸)、NHS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、BSA(牛血清蛋白)購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；海藻糖、蔗糖、Triton X-100、吐溫-20、疊氮鈉、Tris(三羥甲基氨基甲烷)購(gòu)自百靈威科技有限公司；有機(jī)磷單克隆、多克隆抗體由深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司提供(其中有機(jī)磷單克隆抗體可有效識(shí)別多種農(nóng)藥，抗體濃度2.5 mg·mL-1)；羊抗鼠IgG購(gòu)自華美生物公司；PVC襯板、樣品墊、硝酸纖維素膜和吸收墊購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；所有試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 熒光納米顆粒的制備

稱(chēng)取0.457 g 2(CdCl2)·5(H2O)至盛有100 mL水的250 mL三頸瓶中，加入0.334 mL TGA，用氫氧化鈉(1 mol·L-1)調(diào)節(jié)溶液pH至11。高速攪拌10 min后加入新配制的NaHTe(由硼氫化鈉和碲粉混合后超聲制得)水溶液(各物質(zhì)的量摩爾比為：CdCl2∶TGA∶NaHTe=1∶2.4∶0.6)，加熱回流2～8 h制得CdTe，該反應(yīng)須在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。隨后，稱(chēng)取7.5 g環(huán)己烷、2.27 g Triton X-100、1.94 g正辛醇和0.5 mL水于燒瓶中制得W/O型微乳液，加入420 μL CdTe，攪拌5 min后加入120 μL TEOS(硅酸四乙酯)與APS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的混合溶液，攪拌均勻后再加入100 μL濃氨水，室溫下避光反應(yīng)24 h。加入10 mL丙酮終止反應(yīng)，高速離心10 min，棄上清，用乙醇和水分別洗滌3次，烘干得SiO2包裹的CdTe納米顆粒(CdTe@SiO2)，用蒸餾水分散納米顆粒，制成 1.0 mg·mL-1懸浮液備用[8]。

2.2 熒光納米顆粒-抗體偶聯(lián)物制備

吸取30 μL熒光納米顆粒(1 mg·mL-1)加入至300 μL MES(50 mmol·L-1)中，再加入100 μL NHS(10 mg·mL-1)及EDC(10 mg·mL-1)，搖床中震蕩混勻30 min。冷凍高速離心，棄去上清液，用500 μL MES(50 mmol·L-1)重懸顆粒，加入適量有機(jī)磷單克隆抗體，搖床中震蕩1 h。再加入500 μL 5% BSA封閉30 min，冷凍高速離心30 min，棄去上清液，用1 mL MES(50 mmol·L-1)洗滌顆粒三次，最后用300 μL 含2%海藻糖的PB 8.0(10 mmol·L-1)溶液重懸顆粒，置于4 ℃保存?zhèn)溆肹12-13]。

2.3 白色微孔制備

用100.0 mmol Tris-HCl pH8.0，2.0%海藻糖，1.0%BSA，0.5% 吐溫-20，0.1%疊氮鈉作為反應(yīng)液。將反應(yīng)液與標(biāo)記好的熒光納米顆粒按照5∶1混勻，混勻后按每孔60 μL加入到96孔酶標(biāo)板內(nèi)，置于-80 ℃超低溫冰箱預(yù)凍4 h，再置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，加帽后置于4 ℃干燥間保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 熒光試紙條的制備

以有機(jī)磷多克隆抗體為硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線。將對(duì)應(yīng)的多克隆抗體用含有2%的海藻糖的PB 7.4稀釋成2.5 mg·mL-1，將稀釋好的抗體用噴膜儀以1.0 μL·cm-1的量，噴涂與硝酸纖維素膜上。將噴好的膜置于37 ℃恒溫干燥箱內(nèi)，烘烤30 min，取出后放于干燥間備用[14-15]。

以羊抗鼠IgG包被的硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線，將羊抗鼠IgG用含有1%的蔗糖的PBS(PH 7.4)稀釋成1.5 mg·mL-1，將稀釋好的二抗用噴膜儀以1.0 μL·cm-1的量，噴涂與硝酸纖維素膜上，將噴好的膜置于37 ℃恒溫干燥箱內(nèi)。烘烤30 min，取出后放于干燥間備用。

試紙條由PVC襯板、樣品墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成。依次將硝酸纖維素膜，樣品墊，結(jié)合墊貼于PVC襯板上(樣品墊與硝酸纖維素膜重疊約3 mm，吸收墊與硝酸纖維膜重疊約4 mm)粘貼好后切成4 mm寬的試紙條，將制備好的試紙條置于密封袋中，加干燥劑，密封，4 ℃保存。

2.5 樣品處理與檢測(cè)

稱(chēng)取2 g粉碎后的中藥樣品(燈籠草、三七、枸杞等)加入至50 mL離心管中，加入8 mL提取液(15%丙酮和1M pH 8.0 Tris混合液)，渦旋震蕩2 min或搖勻后超聲提取2 min，高速離心2 min，離心管中上層液體即為待測(cè)液。吸取200 μL待測(cè)液加入白色微孔內(nèi)，吹打數(shù)次使微孔內(nèi)液體混勻，靜置5 min后插入試紙條并計(jì)時(shí)8 min。時(shí)間到后可用便攜式熒光檢測(cè)儀讀出判定結(jié)果或借助紫外燈肉眼判斷。

2.6 檢測(cè)原理與結(jié)果判定

若待測(cè)液中含有對(duì)硫磷、蠅毒磷或豐索磷中的一種或幾種，則目標(biāo)化合物會(huì)與白色微孔內(nèi)的抗體-熒光納米顆粒偶聯(lián)物結(jié)合，并朝著吸收墊方向移動(dòng)。當(dāng)移動(dòng)至檢測(cè)線時(shí)，被檢測(cè)線上的單抗所捕獲，在紫外燈下呈現(xiàn)出明亮的檢測(cè)線；未與目標(biāo)化合物結(jié)合的偶聯(lián)物則會(huì)繼續(xù)向吸收墊方向移動(dòng)，直至被質(zhì)控線上的抗鼠IgG捕獲，在紫外光照射下可觀察到具有紅色熒光的質(zhì)控線。

紫外燈輔助肉眼判讀依據(jù)：如果有質(zhì)控線可見(jiàn)檢測(cè)線不可見(jiàn)，則結(jié)果為陰性；如果質(zhì)控線和檢測(cè)線同時(shí)可見(jiàn)，則結(jié)果為陽(yáng)性；如果質(zhì)控線不可見(jiàn)，則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

便攜式熒光檢測(cè)儀判讀依據(jù)：便攜式熒光檢測(cè)儀可對(duì)試紙條檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度進(jìn)行讀值，讀值≤100則檢測(cè)結(jié)果為陰性(-)，讀值>100則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(+)。

2.7 特異性、靈敏性與適用性

用提取液配制一定濃度的對(duì)硫磷、蠅毒磷、豐索磷、甲基對(duì)硫磷、三唑磷、喹硫磷、毒死蜱、克百威及異丙威的標(biāo)準(zhǔn)溶液(待測(cè)液)，用熒光試紙條檢測(cè)，評(píng)價(jià)試紙條的特異性；在空白中藥樣品枸杞中分別添加不同濃度的對(duì)硫磷、蠅毒磷或豐索磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，參照2.5進(jìn)行樣品處理，用熒光試紙條進(jìn)行檢測(cè)，確定試紙條的靈敏性；選取幾種不同的陰性農(nóng)藥樣本，分別添加對(duì)硫磷、蠅毒磷及豐索磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)至試紙條具有清晰的檢測(cè)線，樣品處理后用熒光試紙條進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其適用性。

3 結(jié)果與分析

3.1 特異性檢測(cè)結(jié)果

配制200、500和2000 ng·mL-1的對(duì)硫磷、蠅毒磷、豐索磷、甲基對(duì)硫磷、三唑磷、喹硫磷、毒死蜱、克百威及異丙威的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用熒光試紙條檢測(cè)，用便攜式熒光檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果判讀，結(jié)果如表1所示。

由特異性試驗(yàn)結(jié)果可以看出該有機(jī)磷熒光試紙條對(duì)對(duì)硫磷、蠅毒磷和豐索磷能夠有效識(shí)別，并且具有較高的靈敏度。由于甲基對(duì)硫磷和對(duì)硫磷結(jié)構(gòu)類(lèi)似，高濃度的甲基對(duì)硫磷可能會(huì)造成試紙條的假陽(yáng)，其他農(nóng)藥對(duì)該熒光試紙條無(wú)明顯干擾。

表1 有機(jī)磷熒光試紙條特異性結(jié)果 ng·mL-1

3.2 靈敏性檢測(cè)結(jié)果

在中藥樣品枸杞中分別添加不同濃度的對(duì)硫磷、蠅毒磷或豐索磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，樣品經(jīng)處理后用有機(jī)磷熒光試紙條測(cè)試，試紙條結(jié)果如圖1所示，便攜式熒光檢測(cè)儀判讀結(jié)果如表2所示。

注：從左至右分別為添加0、10、30、50、70和90 ng·g-1圖1 枸杞中添加不同濃度對(duì)硫磷(A)、蠅毒磷(B)及豐索磷(C)標(biāo)品的試紙條檢測(cè)結(jié)果

如圖1-A所示，樣品中對(duì)硫磷含量為10 ng·g-1時(shí)即可在熒光試紙條上清晰的觀察到檢測(cè)線，此時(shí)檢測(cè)儀結(jié)果為陽(yáng)性，讀值在260附近，對(duì)硫磷含量增加至30 ng·g-1時(shí)試紙條的檢測(cè)線已具有相當(dāng)強(qiáng)的熒光，此時(shí)檢測(cè)儀讀值在440附近，繼續(xù)增加對(duì)硫磷的含量試紙條的檢測(cè)線已觀察不到明顯變化，而檢測(cè)儀讀值升高至550附近；圖1-B中蠅毒磷加標(biāo)量為10 ng·g-1時(shí)熒光試紙條上可以觀察到較淡的檢測(cè)線，此時(shí)檢測(cè)儀結(jié)果為陽(yáng)性，讀值120附近，樣品中蠅毒磷含量增加至50 ng·g-1后試紙條檢測(cè)線熒光強(qiáng)度的變化趨于平緩；由圖1-c則可以看出該熒光試紙條對(duì)豐索磷的靈敏性要弱于對(duì)硫磷和蠅毒磷，加標(biāo)至30 ng·g-1時(shí)試紙條上才出現(xiàn)較弱的檢測(cè)線，此時(shí)檢測(cè)儀結(jié)果為陽(yáng)性，讀值在130附近。該該有機(jī)磷熒光試紙條對(duì)對(duì)硫磷、蠅毒磷和豐索磷檢出限分別為：10、10和 30 ng·g-1。

隨著樣品中豐索磷含量的增加，對(duì)應(yīng)試紙條的檢測(cè)線也呈梯度變亮(圖1-C)，檢測(cè)儀的讀值(表2)也近似線性的增長(zhǎng)，低濃度下試紙條對(duì)蠅毒磷的響應(yīng)也有一定的梯度，該熒光試紙條對(duì)樣品中單一有機(jī)磷農(nóng)藥的定量檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 適用性檢測(cè)結(jié)果

表2 有機(jī)磷熒光試紙條靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

表3 不同藥樣本的適應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果

不同中藥樣本的適用性檢測(cè)結(jié)果如表3所示，樣品處理后取上清直接檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定；與金銀花和蓮子相比，當(dāng)歸、板藍(lán)根等由于色素較深，造成熒光檢測(cè)儀陽(yáng)性讀數(shù)稍低，但從對(duì)硫磷試紙條檢測(cè)結(jié)果的照片(圖2)可看到檢測(cè)線亮度無(wú)明顯差異，說(shuō)明該有機(jī)磷熒光試紙條對(duì)多種中藥樣本具有良好的適用性。

注：1.燈籠草；2.三七；3.枸杞；4.當(dāng)歸；5.板藍(lán)根；6.保首烏；7.白芍；8.金銀花；9.覆盆子；10.蓮子圖2 不同樣本添加對(duì)硫磷的試紙條檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

本研究以膠體金免疫層系技術(shù)為基礎(chǔ)，用發(fā)光性極強(qiáng)的CdTe@SiO2熒光納米顆粒標(biāo)記物取代傳統(tǒng)的膠體金標(biāo)記物，制備有機(jī)磷熒光免疫層析試紙條，該技術(shù)為中藥材的農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，特別是有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥提供了一項(xiàng)新的快速檢測(cè)方法。該方法對(duì)中藥中有機(jī)磷(對(duì)硫磷、蠅毒磷、豐索磷)的檢出限達(dá)到10～30 ng·g-1，優(yōu)于傳統(tǒng)膠體金法的200～500 ng·g-1[14-15]，具有較高的靈敏度，檢測(cè)時(shí)間僅需15～20 min。該方法特異性較高，添加10倍量的三唑磷、克百威等農(nóng)藥對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，并且該方法適用性廣，對(duì)多數(shù)農(nóng)藥樣本均具有良好的檢測(cè)效果。

隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品安全的關(guān)注也越來(lái)越多，特別是作為治病保健的中藥，其質(zhì)量安全更需要得到保障。農(nóng)藥在中藥材的種植過(guò)程中被廣泛使用，其殘留可能?chē)?yán)重危害人們的健康，因此對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要意義[16-17]。本研究的有機(jī)磷熒光試紙條較傳統(tǒng)的氣相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等具有成本，操作，時(shí)間及便捷性上的巨大優(yōu)勢(shì)，可廣泛應(yīng)用于中藥有機(jī)磷殘留的現(xiàn)場(chǎng)篩查和檢測(cè)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

[1] 程惠珍，陳君，丁萬(wàn)隆.中藥材生產(chǎn)中的植保問(wèn)題及對(duì)策[J].中藥材，2001(1)：11-13.

[2] 榮維廣，郭華，楊紅.我國(guó)中藥材農(nóng)藥殘留污染研究現(xiàn)狀[J].農(nóng)藥，2006，45(5)：302-305.

[3] 孔令軍，張亞婷，谷令彪，等.中藥材農(nóng)藥殘留的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(21)：231-234.

[4] 鐘瑤.不同中藥制劑中有機(jī)農(nóng)藥多殘留分析新技術(shù)研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2014.

[5] 劉芳，歐陽(yáng)慧子，柴士偉，等.GC法檢測(cè)72種中藥飲片有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量[J].中國(guó)藥房，2016，27(36)：5147-5150.

[6] 夏高峰.QuEchERS前處理技術(shù)在中藥材農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[7] 佟鶴芳，薛健，吳曉波，等.中藥材農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13(6)：49-54.

[8] 何暉，王炳志，畢思遠(yuǎn)，等.一種快速篩查志賀氏菌的熒光納米免疫層析方法的建立[J].食品安全導(dǎo)刊，2016(9)：115-119.

[9] 湯軼偉，張宏，崔世萌，等.熒光標(biāo)記免疫層析技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展[J/OL].食品工業(yè)科技：1-9.(2017-09-21).

[10] 劉道峰，鄧省亮，賴衛(wèi)華.新型層析快速檢測(cè)技術(shù)及其在食品安全中的應(yīng)用[J].食品與機(jī)械，2011，27(6)：261-264.

[11] 湯軼偉，高子媛，魏立巧，等.標(biāo)記免疫層析技術(shù)在食品安全檢測(cè)中應(yīng)用進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014，5(7)：1913-1917.

[12] 白亞龍.一種基于量子點(diǎn)熒光微球的高靈敏度免疫層析技術(shù)初步研究[D].上海：上海師范大學(xué)，2010.

[13] Yu J，Su J，Zhang J，et al.CdTe/CdS quantum dot-labeled fluorescent immunochromatography test strips for rapid detection of Escherichia coli O157：H7[J].RSC Advances，2017，7(29)：17819-17823.

[14] 劉瑩.有機(jī)磷農(nóng)藥的膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的研制[D].上海：上海師范大學(xué)，2009

[15] 華修德.有機(jī)磷農(nóng)藥單殘留及多殘留免疫分析方法的建立與應(yīng)用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[16] 顧炎.薛健，金紅宇，等.金銀花中有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥測(cè)定方法建立及殘留狀況調(diào)查[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18(9)：1148-1152.

[17] 楊崇仁.中藥農(nóng)藥現(xiàn)狀與對(duì)策[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，(8)：633-637.