多花黃精組培苗快速繁殖體系建立研究△

莫勇生，盧拓方*，邱展鴻，張紅巖，孫文波

(1.廣西科學院生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西華泰生物科技有限公司，廣西 昭平 546800)

多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua為百合科黃精屬多年生草本植物，野生資源主要分布于廣西賀州境內昭平、八步縣區，根莖形狀呈姜型。其生長環境多處于山坡背陽面小灌木叢中，植株高約30～40 cm，葉片呈長弧形。

成熟后的多花黃精其干燥根莖入藥。據傳統醫藥經典記載，黃精屬于名貴中藥，具有寬中益氣、益腎填精、滋陰潤肺，生津補脾之功效[1-2]。 對治療心血管疾病、結核病、慢性肝炎以及在抗菌、解毒、抗疲勞、抗衰老、降血糖、降血脂抗腫瘤等方面均有較好作用。黃精既可入藥，又可作為保健食品的原料。隨著市場對黃精藥材需求量的增加和野生資源的急劇減少，采集野生黃精不但不能滿足市場需求，反而可能破壞生態環境和多花黃精野生資源。由此人們逐漸開始對多花黃精的野生變家種栽培技術、高產栽培技術等加以實踐。目前多花黃精的人工種植主要依靠根莖繁殖和種子繁殖，但根莖繁殖方法繁殖系數低，種根莖用量大，既不經濟，又限制了多花黃精的產量潛力，不便栽植管理推廣。多花黃精種子繁殖的繁殖系數比較高，但用時比較久，一般種子繁殖移栽苗需要3年時間。因此說，目前多花黃精種苗問題成為制約黃精人工大規模種植的瓶頸[3]。利用植物組織培養技術建立起多花黃精組培苗規模化生產體系是生產優質多花黃精種苗有效的途徑。

多花黃精為多年生植物，地下根莖常附著太多土壤微生物，若用根莖作為外植體進行組織培養，在消毒滅菌環節很難把控。本試驗曾多次用根莖作為外植體，污染率高，很難獲得無菌培養組織，所以最終采取用成熟種子來萌發芽獲得無菌外植體材料。本研究對黃精的繁殖從種子到組培種苗過程進行研究，為多花黃精種苗規模化生產提供科學依據，以達到短期內生產出大量優質種苗的目標，可以應用到黃精的人工種植產業。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 黃精種子 多花黃精生長于賀州市昭平縣廣西華泰生物科技有限公司生產基地，種子植株花白色，花期5～6月，果期8～10月，地下根莖呈姜狀。成熟的多花黃精種子采收于2016年10月，清洗并浸水30 min后用紗袋包裹放置于26 ℃恒溫干燥培養箱催芽待用。

1.1.2 培養基 MS培養基為基本培養基[3-4]，建立多花黃精組織培養的三種培養基配方：

誘導培養基：

配方培養基種類激素濃度/mg·L-16?BANAAGA3A1MS1 00 20 0A2MS1 00 20 5A3MS1 50 20 0A4MS1 50 20 5A5MS2 00 20 0A6MS2 00 20 5

增殖培養基：

配方培養基種類激素濃度/mg·L-16?BANAAB1MS0 50 2B2MS1 00 2B3MS1 50 2B4MS2 00 2B5MS2 50 2B6MS3 00 2

生根培養基：

配方培養基種類激素濃度/mg·L-1IBANAAC11/2MS0 20 02C21/2MS0 50 05C31/2MS0 80 08C41/2MS1 00 10C51/2MS1 20 12C61/2MS1 50 15

以上培養基均為添加蔗糖20 g·L-1，瓊脂粉4 g·L-1，PH值為5.8～6.0。

1.2 方法

黃精組織培養過程均在超凈工作臺內進行無菌操作。培養房環境溫度為(26±2)℃，光照強度為2000 Lx，時間12 h·d-1。

1.2.1 種子消毒與萌芽 將培養箱中催芽待用的種子，浸水去掉漂浮的種子用自來水漂洗三次。在超凈工作臺內進行消毒處理：將種子放入玻璃瓶內，用無菌水沖洗3次用75% 酒精漂洗30 s，倒掉酒精，用0.13% 的氯化汞溶液表面滅菌4～6 min后，再用無菌水沖洗4～5次，取出種子用無菌紗布瀝干。將種子接至誘導培養基上，每瓶接3顆種子，每個配方接20瓶，放在培養室培養。啟動誘導前階段(5～10 d)，種子萌發形成小球莖，繼續培養5～10 d，小球莖組織形成生長點而萌發出芽，接種25 d后，觀察各個配方的萌芽情況。

1.2.2 繼代增殖培養 萌芽的小球莖繼續培養，球莖基部繼續膨大，長到1 cm左右大小時，將球莖切成0.2～0.3 cm的小塊接種至繼代增殖培養基中。每瓶只接入5個點，每個配方接種20瓶。放置培養房內培養25 d，小球莖繼續萌發出芽，觀察和統計各自增殖情況，重復三次試驗。

1.2.3 生根壯苗 在繼代增殖培養過程中，選取株型較好，植株粗壯的繼代苗，接種于生根培養基中。每瓶接入4株苗，每個配方接種20瓶。放置培養室先暗培養20 d轉光照培養20 d，觀察和統計各自生根情況。

1.2.4 室外煉苗移栽 生根培養40 d后，搬出培養房，放置自然環境7 d，選取有3條以上正常根系的生根苗，清洗掉根系附著的培養基，栽植于(沙子∶泥炭土=1∶1)的煉苗基質中，每10 d噴施1次營養液，30 d后統計成活率。

2 結果與分析

2.1 無菌外植體的獲得

種子處理接種培養第10 d，觀察發現有的種子開始萌發芽(圖1)，25 d后觀察發現萌芽基部膨大分化成球莖(圖2)。

圖1 接種的種子

圖2 發芽的種子

試驗過程中記錄和統計數據得出表1。由表1可以看出，啟動培養基配方當中，BA濃度升高，其萌芽率也隨之提高。在試驗過程中觀察發現當BA濃度提高到2.0 mg·L-1(A5、 A6)濃度時，其萌芽率雖然較高，可是基部出現較多愈傷組織(圖3)，這可能是由于激素濃度過高造成的。因此啟動培養誘導芽階段BA濃度不宜超過1.5 mg·L-1。在實驗過程中還發現，添加GA3的A2、 A4、A6配方均在培養10 d左右就開始萌芽，沒有添加GA3的A1、 A3、A5均在15 d后才開始萌發，結合試驗統計數據還看出在相同BA濃度基礎上，GA3對萌發率影響不大，但是對萌發速度有明顯加快(10 d左右萌發)。

表1 不同激素配方組合對誘導萌芽的影響

注：上.形成愈傷組織；下.正常萌發圖3 在培養基上萌發的種子

2.2 不同激素濃度對黃精的繼代增殖影響

在繼代增殖過程中，主要考慮細胞分裂素(6-BA)對芽增殖影響，生長素NAA固定濃度0.2 mg·L-1配合使用。在啟動獲得無菌外植體成功后，將帶有萌芽的球莖切成0.2 cm左右大小接種于設計的6組繼代增殖培養基中，25 d后均可以產生叢生芽以達到增殖目的(圖4)。

圖4 多花黃精繼代苗

根據實驗過程的觀察和記錄，此培養過程中做的三次重復試驗，每次接種芽數均為100個，(三次試驗新芽數B1：133、128、135；B2：159、163、156；B3：202、205、198；B4：251、255、246；B5：256、261、266；B6：303、309、300；)每組激素濃度配方的三次新芽數相差均在±10個以內，可以看出各組激素濃度對增殖影響的相對穩定性，由此綜合統計得出表2。

表2 不同激素濃度對繼代增殖的影響

由表2可以看出，在黃精繼代增殖過程中，6-BA濃度相對提高，其增殖系數也相應提高，當濃度超過2.0時，表2中B5和B6配方增殖系數分別為2.6和3.0，均比B4(增殖系數為2.5)高，但在繼代過程中觀察發現B5和B6組別繼代苗長勢弱小明顯，不利于后面的生根壯苗培養，達不到優質種苗要求。

2.3 不同激素濃度對生根影響

在生根壯苗過程中，為更好促進壯苗生根，培養基采用1/2MS，激素調節主要考慮生長素對生根的影響，IBA和NAA均屬于生長素，對生根有促進作用，本次試驗中，設計IBA/NAA比值為10∶1的6個不同梯度的生根壯苗配方(C1-C6)。接種培養40 d，根據試驗過程觀察和記錄數據，結果見表3。

表3 不同濃度激素對生根影響

由表3可以看出，IBA濃度低于1.0，生根狀態良好，但是生根率較低。IBA濃度在1.0時，其生根率和生根狀態處于一個較佳狀態(圖5)，當超出1.0濃度時候，生根率雖然略有提高，但每株根數太多，根須細小(圖5)，煉苗時候根須太多且過長不方便移栽，根須弱導致吸附營養能力不強，不利于提高室外煉苗的成活率。

注：上.正常生根苗；下.根須多細長圖5 生根培養的組培苗

2.4 組培苗室外煉苗

在清洗好的生根苗(圖6)，選取3～8條根一組移栽100株，9條根以上一組移栽100株，移栽到煉苗杯中(沙子∶泥炭土=1∶1)，每10 d噴施1次營養液，30 d后生長穩定(圖6)，通過觀察和統計數據得出表4。

注：上.生根苗；下.煉苗圖6 黃精組培苗的煉苗移栽

根須數移栽株數成活株數成活率4～810095959條以上1007171

由表4看出，根數太多，不但在移栽過程中不方便操作，且其移栽成活率相對較低，為2.3中最佳生根配方選擇提供了佐證。

3 結論

在利用多花黃精根莖進行離體組織培養過程中，其無菌體系建立存在困難，主要原因是地下根莖中微生物多，根莖本身也存在內生菌[4]。因此，如何建立無菌培養體系是多花黃精快速繁殖系統首先要解決的難題。在研究中，成功的利用多花黃精種子作為外植體，通過種子表面滅菌，在提供幾種植物生長激素的情況下，建立了多花黃精的增殖誘導、快速擴增及生根培養和煉苗移栽體系。

在繼代增殖和生根過程中，添加的外源激素濃度與多花黃精組培快繁之間存在一定的關系，選擇合適的外源植物生長激素的配比是關鍵。這與許多植物組培相關文章中提到的激素濃度對植物組培生產影響相一致[5-6]。本文試驗中，得出多花黃精組培過程中，無菌培養誘導和繼代增殖的最佳培養基分別為：MS基本培養基附加6-BA(1.5 mg·L-1)，NAA(0.2 mg·L-1)，GA3(0.5 mg·L-1)和MS基本培養基附加6-BA(2.0 mg·L-1)，NAA(0.2 mg·L-1)；生根壯苗階段的最佳培養基為1/2 MS基本培養基附加IBA(1.0 mg·L-1)，NAA(0.1 mg·L-1)。多花黃精組培瓶苗不能直接下地移栽種植，必須先經過瓶外煉苗階段，用煉苗基質進行裝杯進行煉苗30 d后才可以大田種植，本文試驗中煉苗成活率達95%以上。本試驗結果直接應用于組培企業生產，可為規模化生產優質多花黃精種苗提供依據。

[1] 鄭云峰，李松濤.黃精的應用與栽培[J].特種經濟動植物，2002(5)：25.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：化工工業出版社.2005.1：232.

[3] 周建金，羅曉峰，葉煒，等.多花黃精組織培養技術.三明農業科技.2012(3)：124.

[4] 萬學鋒，陳菁瑛.多花黃精組培技術初探.中國現代中藥，2013，15(10)：850.

[5] 徐紅梅，趙東利.植物生長調節劑對多花黃精芽體外發生過程中性狀的影響[J].中草藥，2003(9)：855-858.

[6] 徐忠傳，何俊蓉，周靜亞，等.6-BA濃度對多花黃精不定芽增殖的影響[J].安徽農業大學學報，2006，33(1)：105-107.