桑白皮多酚的抗氧化和對UV輻射致成纖維細胞光老化的修復作用

吳永祥

吳麗萍1

王衛東2

金泰完3

(1.黃山學院生命與環境科學學院，安徽 黃山 245041；2.黃山峰源生物科技有限公司，安徽 黃山 245600；3.安東國立大學食品科學與生物技術學院，韓國 安東 760749)

皮膚光老化(Photoaging)是指由于皮膚長期暴露在外界有害因素(日曬、煙塵、化學物質等)之下使得皮膚過早地出現衰老現象的一類疾病，其中紫外線是最為主要的誘因[1]。UV輻射會引起成纖維細胞生物學特征的改變，表現為皮膚粗糙、增厚、過多的色素沉著及出現深皺紋[2-3]。長期過量的UV輻射甚至會引起皮膚癌變，嚴重損害人體健康[4]。研究[5-6]表明，許多植物提取精華和中草藥中的化學物質可有效防治皮膚光老化。

桑白皮是桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥根皮，為中國傳統常用中藥材，主產于安徽、四川、貴州、湖南等地。桑白皮多酚是桑白皮的次生代謝產物，主要包括Diels-Alder型加合物和黃酮類化合物等[7]。桑白皮多酚具有多種生物活性，包括抗氧化[8]、抗病毒[9]、鎮痛抗炎[10]、降血糖[11]及改善胰島素抵抗[12]等。本課題組前期研究[13]發現桑白皮多酚提取物具有抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶及3T3-L1脂肪細胞分化的作用。雖然桑白皮多酚藥理作用的研究較多[10-13]，但關于桑白皮多酚對UV輻射致皮膚光老化修復作用的研究仍然缺乏。

本試驗擬以桑白皮多酚為原料，首先研究CMP的抗氧化能力，在以成纖維HS68細胞為研究對象，探討CMP對UV輻射致成纖維細胞光老化的修復作用，并闡明其作用機制，為抗光老化功能性食品的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

桑白皮：安徽亳州藥材市場；

成纖維HS68細胞：美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)；

單寧酸(tannic acid, TA)、Folin-Ciocalteu試劑、BHA、ABTS、DPPH、MTT：分析純，美國Sigma公司；

PIP試劑盒：日本TaKaRa公司；

胎牛血清、DMEM培養液等：美國Gibco公司。

1.1.2 主要儀器設備

全波長酶標儀：SpectraMax-190型，美國Molecular Devices公司；

CO2恒溫培養箱：NU-8500型，美國Thermo公司；

超凈工作臺：DL-CJ-1N型，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZF-75KB-III型，上海申安醫療器械廠；

實時熒光定量PCR儀：ECOTM型，美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑白皮多酚提取物的制備 將桑白皮粉碎成粉末，按照料液比1∶10 (g/mL)與70%的乙醇溶液進行混合，室溫條件下振蕩提取3次，每次4 h，過濾后收集上清液，用旋轉蒸發儀濃縮至適量。取提取液加在處理好的大孔吸附樹脂柱上，用蒸餾水洗脫，再依次使用不同純度的乙醇沖洗，收集洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，冷凍干燥得桑白皮多酚提取物。

1.2.2 多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu法[14-15]，以單寧酸作為標準品。繪制吸光值Y-質量濃度X的標準曲線Y=0.001X-0.005，R2=0.999。根據標準曲線，計算桑白皮多酚的含量(mg TA/g)。

1.2.3 抗氧化活性的測定

(1) ABTS自由基清除能力：參考文獻[16]。

(2) DPPH自由基清除能力：參考文獻[17～18]。

1.2.4 成纖維細胞的培養及細胞光老化模型的建立 成纖維HS68細胞置于(+)DMEM培養基(含100 U/mL 青鏈霉素、10%胎牛血清)，在37 ℃、5% CO2且相對飽和濕度的細胞培養箱中培養。取對數生長期的HS68細胞，以1×105個/mL 接種于24孔板中，每孔500 μL。貼壁培養24 h后，棄培養基，用PBS清洗2次，并鋪上500 μL的PBS，置于紫外線燈下輻射。輻射條件：輻射劑量20 mJ/cm2，時間90 s，細胞距離光源20 cm[19]。空白對照組不給予UV輻射。棄PBS，加入DMEM培養基(含100 U/mL 青鏈霉素、但不含10%胎牛血清)培養。

1.2.5 試驗分組 將成纖維HS68細胞設置為空白對照組(無UV輻射及CMP處理)、UV模型組(給予UV輻射，無CMP處理)、CMP試驗組(給予UV輻射及CMP處理)，各組均設4個復孔。CMP處理濃度為1，2，5 μg/mL。

1.2.6 細胞增殖活性的測定 接種于24孔板中的HS68細胞，給不同濃度CMP(1，2，5 μg/mL)處理48 h后，每孔加入50 μL的MTT染色液，繼續置于細胞培養箱中培養，3 h 后棄上清液，每孔加入500 μL二甲基亞砜溶液，室溫避光震蕩20 min，于570 nm波長處讀取OD值[20]。

1.2.7 PIP含量的測定 將接種于24孔板中的HS68細胞用不同濃度CMP(1，2，5 μg/mL)處理48 h后，收集細胞上清液，采用ELISA法測定細胞培養液中PIP含量，操作方法參考PIP試劑盒說明書。

1.2.8 MMP-1、PIP mRNA表達水平的測定 取HS68細胞以1×105個/mL接種于60 mm的細胞培養皿中，經不同濃度CMP(1，2，5 μg/mL)處理48 h后，用Trizol法提取總RNA，按照PrimeScriptTMRT試劑盒合成cDNAs。加入SYBR Green、引物及cDNA模板，進行實時熒光定量PCR反應。引物設計：MMP-1正義引物為5’-GGT GAT GAA GCA GCC CAG-3’，MMP-1反義引物為5’-CAG TAG AAT GGG AGA GTC-3’；PIP正義引物為5’-GAA CGC GTG TCA TCC CTT GT-3’，PIP反義引物為5’-GAA CGA GGT AGT CTT TCA GCA ACA-3’；β-actin正義引物為5’-GTT GGA CCT GAC AGA CTA CCT CA-3’，β-actin反義引物為5’-GTT GCC AAT AGT GAT GAC CT-3’。

1.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 桑白皮多酚對ABTS自由基的清除作用

由圖1可知，CMP具有顯著清除ABTS自由基的能力，且清除率隨著質量濃度的增大先逐漸增強最后趨于恒定；BHA在1～10 μg/mL時，清除率隨著質量濃度的增加而增大，且呈線性相關。CMP和BHA對ABTS自由基清除作用的IC50值分別為1.49，11.25 μg/mL，表明CMP對ABTS自由基清除能力顯著強于陽性對照BHA(P<0.05)。故桑白皮多酚具有顯著的ABTS自由基清除能力，而多酚類物質是其主要的活性成分。

圖1 桑白皮多酚對ABTS自由基的清除作用Figure 1 ABTS free radical scavenging ability of polyphenol from Cortex Mori

2.2 桑白皮多酚對DPPH自由基的清除作用

圖2表明，在1～10 μg/mL時，CMP和BHA對DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增強，呈明顯的濃度依賴性，且差異顯著(P<0.05)。CMP和BHA清除DPPH自由基的IC50值分別為8.94，11.03 μg/mL，說明桑白皮多酚對DPPH自由基清除能力大于人工合成抗氧化劑BHA。以上結果顯示，桑白皮多酚對DPPH和ABTS自由基清除能力的變化規律具有較好的一致性，說明多酚類物質是桑白皮的主要抗氧化活性成分。

圖2 桑白皮多酚對DPPH自由基的清除作用Figure 2 DPPH free radical scavenging ability of polyphenol from Cortex Mori

2.3 桑白皮多酚對細胞增殖作用的影響

由圖3可知，成纖維HS68細胞經UV輻射后，細胞存活率明顯降低，與空白對照組比較具有顯著性差異(P<0.05)，表明體外HS68細胞光老化模型建立成功。與UV模型組[(60.90±0.46)%]相比，不同濃度CMP(1，2，5 μg/mL)作用48 h后，其細胞存活率分別為(64.78±1.84)%，(70.89±2.20)%，(75.76±0.68)%，呈劑量依賴性增加，且具有統計學意義(P<0.05)。說明桑白皮多酚能提高光老化成纖維細胞的增殖活性，對細胞損傷具有一定的修復作用。后續試驗細胞PIP分泌水平及MMP-1、PIP的mRNA表達的測定均采用此濃度的添加量進行研究。

不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05圖3 桑白皮多酚對細胞增殖作用的影響Figure 3 Effect of polyphenol from Cortex Mori on cell proliferation

2.4 桑白皮多酚對細胞PIP含量的影響

由圖4可知，PIP標準品的質量濃度(Y)與OD值(X)間的標準曲線為Y=47.12X2+106.4X-1.914(R2=0.999)，說明方程擬合有效。由圖5可知，成纖維HS68細胞經過UV輻射后，其PIP的含量發生了變化。與空白對照組[(624.09±10.93) ng/mL]相比，UV模型組PIP含量明顯降低，達到了(497.58±17.38) ng/mL，存在著顯著性差異(P<0.05)。與UV模型組相比，CMP可以顯著提高UV輻射后細胞中的PIP含量，隨著CMP濃度的增加，PIP含量呈濃度依賴性提高，且有統計學差異(P<0.05)。PIP含量的降低，可導致皮膚中膠原蛋白合成的減少，從而出現皺縮細紋等衰老癥狀[21]。本試驗結果表明，桑白皮多酚增加了UV輻射后成纖維細胞中PIP的含量，具有潛在的抗光老化作用。

圖4 PIP標準曲線Figure 4 Standard curve of PIP

不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05圖5 桑白皮多酚對細胞PIP含量的影響Figure 5 Effect of polyphenol from Cortex Mori on PIP content

2.5 桑白皮多酚對細胞MMP-1、PIP mRNA表達的影響

由表1可知，與空白對照組相比，UV模型組在給予UV輻射后，細胞中MMP-1的mRNA表達水平顯著升高，PIP的mRNA 表達水平顯著降低。空白對照組中MMP-1、PIP的mRNA表達水平分別為(0.08±0.00)，(1.00±0.00)，而UV模型組分別為(1.00±0.00)，(0.33±0.01)，兩者存在著顯著性差異(P<0.05)。與UV模型組相比，CMP能夠顯著下調UV輻射損傷細胞內MMP-1的mRNA表達量，提高PIP的mRNA水平，且有統計學差異(P<0.05)。研究[22]證明，MMP-1過度表達時，將會抑制PIP的正常表達，破壞皮膚膠原纖維和彈性纖維的正常結構，從而導致皮膚光老化。結果表明，桑白皮多酚通過調控MMP-1和PIP的mRNA表達，起到光老化修復作用。

表1桑白皮多酚對細胞MMP-1、PIP mRNA表達的影響?
Table 1 Effect of polyphenol fromCortexMorion MMP-1, PIP mRNA expressions

組別濃度/(μg·mL-1)MMP?1/β?actin比值PIP/β?actin比值空白對照組-0．08±0．00d1．00±0．00aUV-1．00±0．00a0．33±0．01dCMP11．03±0．04a0．35±0．03cd20．91±0．02b0．39±0．01bc50．84±0．02c0．42±0．02b

? 同列不同上標字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)。

3 結論

本研究揭示了桑白皮多酚能有效抵抗UV誘導的皮膚光老化，其作用機制可能與有效清除自由基，抑制細胞內MMP-1表達及調控PIP合成有關。下一步將對桑白皮多酚做進一步的分離純化，以明確桑白皮多酚抗皮膚光老化的主要活性成分。

[1] 高擎, 金鑫, 葛亞中, 等.組方提取物A的抗光化功效及其機理研究[J].現代食品科技, 2016, 32(8): 100-106.

[2] CHOI J W, LEE J, PARK Y I.7,8-Dihydroxyflavone attenu-ates TNF-α-induced skin aging in Hs68 human dermal fibroblast cells via down-regulation of the MAPKs/Akt signaling pathways[J].Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 95: 1 580-1 587.

[3] 殷花, 林忠寧, 朱偉.皮膚光老化發生機制及預防[J].環境與職業醫學, 2014, 31(7): 565-569.

[4] 樊迎, 王常青, 王菲, 等.黑豆乳清多肽抗皮膚光老化作用的研究[J].天然產物研究與開發, 2013, 25(4): 539-543.

[5] 路婷婷, 陳亞澤, 盧濤, 等.紫外線的皮膚損傷機制及具有紫外線防護作用的天然產物的研究進展[J].中國藥理學通報, 2012, 28(12): 1 655-1 659.

[6] HA S J, LEE J, KIM H, et al.Preventive effect ofRhusjavanicaextract on UVB-induced skin inflammation and photoaging [J].Journal of Functional Food, 2016, 27: 589-599.

[7] 李墨靈, 張晗, 夏慶梅.桑白皮的化學、藥理與藥代動力學研究進展[J].西部中醫藥, 2017, 30(2): 137-139.

[8] DAI Sheng-jun, WU Yan, WANG Ying-hong, et al.New diels-alder type adducts fromMorusmacrouraand their antioxidant activities[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2004, 52(10): 1 190-1 193.

[9] DU Jiang, HE Zhen-dan, JIANG Ren-wang, et al.Antiviral flavonoids from the root bark ofMorusalbaL.[J].Phytochemis-try, 2003, 62(8): 1 235-1 238.

[10] 俸婷婷, 謝體波, 林冰, 等.桑白皮總黃酮的鎮痛抗炎藥理作用研究[J].時珍國醫國藥, 2013, 24(11): 2 580-2 582.

[11] ZHANG Mi, CHEN Man, ZHANG Han-qing, et al.Invivohypoglycemic effects of phenolics from the root bark ofMorusalba[J].Fitoterapia, 2009, 80(8): 475-477.

[12] 高穎, 高英, 李艷, 等.桑白皮黃酮提取物對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響[J].廣州中醫藥大學學報, 2016, 33(6): 831-835.

[13] WU Yong-xiang, KIM Y J, LI Sha, et al.Anti-obese effects of mulberry (MorusalbaL.) root bark through the inhibition of digestive enzymes and 3T3-L1 adipocyte differentiation[J].The Korean Society of Food Preservation, 2015, 22(1): 27-35.

[14] 吳永祥, 王祥, 江海濤, 等.不同極性柳葉蠟梅葉萃取物總酚含量及其抗氧化、抑菌能力研究[J].食品與機械, 2017, 33(8): 150-154.

[15] 宋麗軍, 候旭杰, 李雅雯, 等.核桃青皮中多酚的超高壓提取工藝優化[J].食品與機械, 2015, 31(4): 178-182.

[16] 嚴鑫, 王委, 劉量.綬草萃取物體外抗氧化活性及其總酚含量比較[J].食品與機械, 2016, 32(8): 143-146.

[17] 吳德智, 鄭強, 李安, 等.纈草總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝優化及抗氧化活性研究[J].食品與機械, 2017, 33(5): 162-167.

[18] 吳永祥, 楊慶, 李林, 等.豆腐柴葉揮發油化學成分及其抗氧化和抑菌作用研究[J].天然產物研究與開發, 2018, 30(1): 45-51.

[19] HUANG Chung-yu, LIN Yi-tzu, KUO Hsiang-chun, et al.Compounds isolated fromEriobotryadeflexaleaves protect against ultraviolet radiation B-induced photoaging in human fibroblasts[J].Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology, 2017, 175: 244-253.

[20] EBADI P, FAZELI M.Anti-photoaging potential of propolis extract in UVB-irradiated human dermal fibroblasts through increasing the expression of FOXO3A and NGF genes[J].Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 95: 47-54.

[21] LEE J J, KIM K B, HEO J, et al.Protective effect ofArthrospiraplatensisextracts against ultraviolet B induced cellular senescence through inhibition of DNA damage and matrix metalloproteinase-1 expression in human dermal fibroblasts[J].Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology, 2017, 173: 196-203.

[22] 劉大旭, 高曉波, 祁永華, 等.杜仲有效成分β-萘黃酮對UVB誘導人皮膚成纖維細胞光老化保護作用研究[J].中醫藥學報, 2016, 44(3): 41-43.