大腸桿菌工程菌產木聚糖酶工藝優化及酶學性質研究

劉國鋒LIU Guo-feng

(1.湖南尤特爾生化有限公司，湖南 岳陽 414000；2.山東尤特爾生物科技有限公司，山東 鄒城 273500)

木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase，EC.3.2.1.8)是一類木聚糖降解酶系，屬于水解酶類。木聚糖酶主要包括：內切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。狹義上的木聚糖酶是指β-1,4-內切木聚糖酶[1-2]。木聚糖酶可用于生物乙醇的生產，在食品、飼料等行業中也有著廣泛的應用[3]。

木聚糖酶是飼料主要用酶之一，其主要作用是分解由五碳糖聚合而成的半纖維素和木聚糖，主要分解產物有木糖、木二糖、木三糖和少量的阿拉伯糖。在食品工業中木聚糖酶也有著比較廣泛的應用，在面包加工過程中添加適量的木聚糖酶不僅能提高面團的機械加工性能，還可以消除發酵過度的影響，增大面包體積，改善面包芯質地以及延緩老化[4]。另外，近年來木聚糖酶廣泛用于酶法生產低聚木糖上，作為功能性低聚糖的一種，低聚木糖在保健食品和醫藥行業有廣泛的應用前景，對高脂血癥有很好的治療效果，能有效地降低血壓、血清膽固醇[5]。目前，對木聚糖酶的研究側重于高產木聚糖酶基因工程菌的構建、木聚糖酶誘導表達優化、木聚糖酶功能基因的鑒定及比較等方面[6-8]。中國生產木聚糖酶的廠家較少，因酶活力單位較低，質量不穩定，木聚糖酶產品主要依靠進口。因此開發高活性的木聚糖酶對打破國外廠家壟斷、提高企業經濟效益方面具有廣闊的前景。本試驗擬在前期研究[9]的基礎上，對工程菌產木聚糖酶提取工藝進行探究，并對獲得的木聚糖酶的酶學性質進行研究，以期為木聚糖酶工業化大生產提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大腸桿菌工程菌發酵液：湖南尤特爾生化有限公司；

丙烯酸樹脂：生化試劑，遼寧三環樹脂有限公司；

中空纖維膜：PWSW-543(0.1 μm，0.08 m2)、UMP153(0.2 μm，0.08 m2)、ULP143 (0.45 μm，0.1 m2)，頗爾過濾器(北京)有限公司；

陶瓷膜、陶瓷超濾膜管單孔道(0.2 μm，0.08 m2)：合肥世杰膜工程有限責任公司。

1.1.2 主要儀器設備

精密pH計：雷磁PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏實驗設備有限公司；

水分快速測定儀：SH10AD型，上海良平儀器有限公司；

濁度測定儀：XZ-0101型，上海海恒機電儀表有限公司；

管式連續流離心機：GQ145WZ型，上海佳毅機械設備公司；

板框壓濾機：1000型，佛山金凱地過濾設備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-8型，常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生產工藝流程

大腸桿菌→搖瓶種子→小罐種子→發酵罐發酵→細胞破碎→中空纖維膜過濾→超濾濃縮→固液混合→搖擺造粒→拋丸→烘干→篩分→包衣→配制→檢驗→包裝→成品

1.2.2 酶的提取工藝

(1) 珠磨法提取木聚糖酶的工藝：將發酵液冷卻至18 ℃ 后，以同一進料速度連續流入DYNO-mill ECM珠磨機中，在不同直徑大小的研磨珠及其裝填系數下進行細胞破碎，檢測破碎液酶活。以實驗室超聲波破碎發酵液測得的酶活為參照，按式(1)計算細胞破碎率。

(1)

式中：

C1——細胞破碎率，%；

U1——珠磨機破碎液酶活，IU；

U2——超聲波破碎液酶活，IU。

(2) 膜分離設備選型及工藝參數優化：選用PWSW-543(0.1 μm，0.08 m2)、UMP153(0.2 μm，0.08 m2)、ULP143 (0.45 μm，0.1 m2) 3種型號的膜柱，采用恒壓過濾模式進行酶制劑澄清過濾。

膜柱化學清洗方法：試驗結束后，用冷水、55 ℃熱水沖洗，再使用1%的堿+300 mg/L過氧化氫在55 ℃清洗10 min。清洗完畢后，通過中空纖維膜柱水通量恢復率來考察中空纖維膜堵塞程度，濁度用濁度測定儀測定。

(3) 超濾濃縮木聚糖酶的工藝研究：將截留分子量為5 000，8 000，10 000，20 000 D聚醚砜(PES)卷式超濾膜分別裝入超濾機中，取適量的中性木聚糖酶倒入超濾桶中，在20 ℃ 同條件下進行濃縮。分別測定超濾透過液酶活、濃縮液酶活，按式(2)計算超濾收率。

(2)

式中：

C2——超濾收率，%；

U3——超濾透過液酶活，IU；

U4——濃縮液酶活，IU。

(4) 固態腸溶木聚糖酶包衣材料選擇：在槽型混合機中將濃縮酶液、玉米淀粉、糊精、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉按照一定比例混合均勻，送入搖擺式顆粒機進行搖擺造粒。將成型后的顆粒使用拋丸機拋圓。將拋圓后的光滑小丸用沸騰干燥制粒機在50 ℃下干燥。將干燥后的小丸用振動篩分選出30～80目的小丸。將不同型號的聚丙烯樹脂放入95%酒精中，按1∶20的質量比混合配制成腸溶包衣材料。將分選出的小丸放入旋流流化床包衣機中，用包衣機配槍把配制的不同腸溶包衣材料均勻噴灑到小丸上，50 ℃下干燥制得固態腸溶木聚糖酶。將腸溶酶置于80 ℃ 5 min、pH 2.5磷酸緩沖液120 min、pH 5.5磷酸緩沖液15 min條件下測酶活。

1.2.3 酶學性質的研究

(1) 木聚糖酶最適pH值和最適溫度的確定：測定木聚糖酶在不同pH(3.2～9.6)及不同溫度(35～70 ℃)條件下的酶活。酶活力單位(IU)規定為：溫度50 ℃、pH 6.5條件下，每分鐘從濃度為5.0 mg/mL的櫸木木聚糖溶液中產生1 μmol 還原糖所需要的酶量，還原糖(采用斐林法測定[10])以木聚糖含量計。木聚糖酶酶活的測定：參照文獻[11]。

(2) 酶的熱穩定性測定：將酶液分別在40，50，60，70 ℃水浴中放置不同時間后，在pH 6.5、50 ℃條件下測定酶活。準確稱取1.000 g樣品，加入10 mL水(加水后總含水量17%)，充分攪拌后蓋嚴，于90 ℃恒溫干燥箱處理2.5，5.0，7.5，10.0 min，立即提取，在pH 6.5、50 ℃條件下測定酶活。

(3) 木聚糖酶降解產物研究：用薄層色譜法鑒定pH 6.5、50 ℃條件下燕麥木聚糖經木聚糖酶降解后的產物種類。

2 結果與討論

2.1 珠磨法工藝參數優化

胞內產物的提取首先需要對細胞進行破碎，細胞破碎方法的選擇直接影響產品品質及生產成本。近年來常用的幾種細胞破碎方法有高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎、酶溶法及化學滲透法[12]。本研究采用高速珠磨法。

從表1可以看出，在相同裝填系數條件下，研磨珠直徑越小，破碎率越高，但電能消耗也遞增。在相同直徑條件下，研磨珠裝填系數越高，破碎率越高，但電能消耗也遞增。選擇第5組工藝參數，破碎效果較好，生產能耗也相對較低。

表1研磨珠直徑及裝填系數對破碎效果的影響
Table 1 The effect of the grinding bead diameter and filling coefficient on the breaking effect

在實際生產過程中發現，細胞破碎次數越多，細胞破碎率越高，但不是無限增大的。當破碎1次后破碎近乎完全時，考慮到經濟性和避免生產操作的復雜，再增加破碎次數是不必要的，因此選擇破碎1次。

2.2 固液分離方法選擇

在固液分離過程中，工業上常用的設備有離心機、板框壓濾機、真空轉鼓過濾機及膜過濾系統[13]。本研究選用管式連續流離心機(10 000 r/min)、板框壓濾機、陶瓷膜系統、中空纖維膜系統對細胞破碎液進行初步測試，結果見表2。

從表2可以看出，選用陶瓷膜系統和中空纖維膜系統處理細胞破碎液比較好。另外，膜過濾系統還能達到一次性過濾澄清物料并去除細菌的效果。

2.3 膜分離方法選擇

在前面的試驗基礎上，按照1.2.2(2)對細胞破碎液進行進一步過濾測試，結果見表3。

從表3可以看出，陶瓷膜孔徑受加工精度的影響，透過液可以檢測出細菌，其濾出液酶活較同孔徑大小的中空纖維膜透過液酶活低。另外，在酶的收率方面，選用陶瓷膜的收率只有75%，小于中空纖維膜的，主要是陶瓷膜系統運行所需壓力較中空纖維膜系統高，酶受剪切力作用大，導致陶瓷膜系統所得收率較中空纖維膜系統收率小。

表2 幾種固液分離方法初步測試結果Table 2 The initial test results of several kinds of solid-liquid separation method

為進一步選擇合適的中空纖維膜型號，按照1.2.2(2)分別進行了測試，結果見表4和圖1、2。

從表4和圖2中可以看出，中空纖維膜膜柱UMP153和膜柱ULP143在恒定過膜壓力0.05 MPa條件下過濾酶液，實際過濾時間分別為1 h 43 min和1 h 5 min，平均通量分別為10.9，16.6 L/(m2·h)。膜柱經過清洗后，水通量恢復率分別為94%，100%。可見，膜柱ULP143過濾酶液，收率高，通量理想，透過液質量滿足控制要求。膜柱采用冷水、55 ℃熱水、55 ℃ 1%的堿液+300 mg/L 過氧化氫上下游同時清洗工藝，可恢復濾膜水通量。因此，后續生產中選用膜柱ULP143中空纖維膜用于固液分離工段。

? “-”表示細胞破碎液濁度超過儀器檢測上限。

表4 膜柱UMP153及膜柱ULP143測試結果?Table 4 The test results of film column UMP153 and film column ULP143

? “-”表示細胞破碎液濁度超過儀器檢測上限。

圖2 UMP153和ULP143過濾過程通量、溫度隨透過液體積的變化趨勢Figure 2 The variation trend of flux and temperature with the volume of penetration liquid in the UMP153 and ULP143 filtration process

2.4 酶液濃縮方法選擇及工藝參數優化

工業生產上常用的酶液濃縮方法有鹽析法、冷凍干燥濃縮法、真空薄膜濃縮法、超濾膜濃縮法[14]。從能耗、環保、提取收率及生產操作等方面考慮，采用超濾膜濃縮法用于工業化大生產。本研究中，木聚糖酶分子量為30 kD，選用不同超濾膜孔徑進行濃縮測試，結果見表5。

從表5可以看出，超濾膜PES20透過的廢液通量最大，但廢液酶活也最高，提取收率受到影響。超濾膜PES5透過的廢液酶活最低，但廢液通量最小，因酶液循環次數多酶蛋白受超濾系統剪切力破壞多，提取收率受到較大影響。超濾膜PES10超濾濃縮酶液，透過的廢液酶活、通量及超濾收率在4組超濾膜中比較理想，能夠滿足生產控制要求。因此，選用超濾膜PES10用于超濾濃縮工段。

2.5 固態腸溶木聚糖酶包衣材料選擇

酶作為飼料添加劑在飼料中得到大量使用。飼用腸溶酶相對顆粒酶在表面設計一層隔水膜，使其在飼料制粒的過程中可以免除高溫水蒸氣引起的酶失活，增加了酶的濕熱穩定性。另一方面，這層隔水膜在強酸性環境中不會崩解，可以保證包含其內的生物酶順利通過動物胃環境而不失活，最后到達偏中性的小腸定點釋放發揮作用。因而，固態腸溶木聚糖酶具有廣闊的市場前景，而生產固態腸溶木聚糖酶的關鍵在于包衣材料的選擇。分別選取腸溶性I、Ⅱ、Ⅲ號丙烯酸樹脂作薄膜包衣材料包衣后，將產品進行高溫及釋放度測試，結果見表6。

由表6中可以看出，考慮到酶活和顆粒外觀的特性，選擇Ⅱ和Ⅲ號丙烯酸樹脂繼續進行包衣優化試驗。將Ⅱ和Ⅲ號丙烯酸樹脂按照不同比例作薄膜包衣材料包衣后，將產品進行高溫及釋放度測試，結果見表7。由表7可知，Ⅱ和Ⅲ號丙烯酸樹脂按照質量比1∶1進行包衣后，產品酶活達到了98.5%、顆粒外觀光澤性好、包衣過程中不易黏連，能夠滿足生產控制要求。

表5 不同孔徑超濾膜超濾測試結果Table 5 The test results of different aperture ultrafiltration membrane

表6 不同型號包衣材料測試結果Table 6 The test results of different types of coating material

表7 不同比例包衣材料測試結果Table 7 The test results of different propotion of coating material

2.6 木聚糖酶的酶學性質研究

2.6.1 木聚糖酶最適條件研究 酶的酶學性質對酶的工業化應用具有重要的作用，酶的最適pH和最適反應溫度是酶的重要性質，本研究對木聚糖酶在不同pH和溫度下的酶活力進行了測定，結果見圖3。由圖3(a)可看出，木聚糖酶活力隨著pH的增加呈現先增加后降低的趨勢，pH為6.4時木聚糖酶活力達到最高。因此，確定木聚糖酶的最適pH為6.4。

由圖3(b)可知，該木聚糖酶的酶活在低于55 ℃下呈緩慢上升趨勢，當溫度高于55 ℃后酶活急劇降低，溫度為55 ℃ 時酶活力最高。

2.6.2 木聚糖酶熱穩定性研究 由圖4可看出，該木聚糖酶在40～50 ℃條件下4 h能100%保持活性，含水量17%的酶在90 ℃條件下2.5 min僅失活13.6%，該木聚糖酶具有較好的熱穩定性。同干熱處理相比，濕熱處理對酶活的影響要大得多，與其他研究者[15-16]得出的結論一致。說明在相同溫度條件下濕熱環境更不利于木聚糖酶保持活力。

2.7 木聚糖酶降解產物的研究

用薄層色譜法測定了收集到的燕麥木聚糖降解產物S1、S2、S3和S4，結果見圖5。由圖5可知，降解產物S1中包含木糖和木二糖；降解產物S2中包含木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖；降解產物S3主要為葡萄糖；降解產物S4主要為阿拉伯糖。降解產物主要包括木二糖、木三糖、木四糖和木五糖，這4種糖占降解產物總量的90%以上，充分說明該木聚糖酶是一種內切酶。

圖3 pH和溫度對酶活力的影響Figure 3 The effect of pH and temperature on the enzyme activity

圖4 酶的濕熱穩定性和含水量為17%時在90 ℃的熱穩定性Figure 4 The curve of hydrothermal stability of enzyme and the themal stability of the enzyme with 17% water content under 90 ℃

A.阿拉伯糖 G.葡萄糖 X1.木糖 X2.木二糖 X3.木三糖 X4.木四糖 X5.木五糖

圖5 酶對燕麥木聚糖的降解產物
Figure 5 The production from the degradation of oat spelt xylan by xylanase

3 結論

本試驗對大腸桿菌工程菌產木聚糖酶提取工藝進行了優化，并對獲得的木聚糖酶酶學性質進行了研究。主要結論如下：

(1) 確定了木聚糖酶的提取工藝路線，在pH 2.5磷酸鹽緩沖液釋放度為5.0%，在pH 5.5磷酸鹽緩沖液釋放度為98.5%，產品外觀光澤性好，能夠很好地滿足市場對木聚糖酶的要求，因此該酶可以作為工業化產品投放市場。

(2) 酶學性質研究表明該酶是一種以內切作用為主的木聚糖酶，最適pH值為6.4，最適溫度為55 ℃，該酶具有較好的熱穩定性，含水分量17%的酶在90 ℃條件下2.5 min僅失活13.6%。該木聚糖酶具有很好的酶學性質。

(3) 目前木聚糖酶的生產和應用具有很大的空間，下一步將考慮拓寬木聚糖酶在工業方面的應用范圍。

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