半自動連續發酵殘次鮮紅棗醋及其有機酸分析

向進樂

關隨霞1,3

馬麗蘋1,2,3

任廣躍1,2

袁云霞1,2

康懷彬1,2

(1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023；3.洛陽市微生物發酵工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

棗(ZizyphusjujubeMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZizyphusMill.)植物，原產于中國，已有4 000多年的栽培歷史。棗樹為多花植物，落花落果現象嚴重[1-2]。另外，棗果易開裂，在紅棗生長期即使不易開裂品種，裂果率也有15%左右；成熟期多雨的年份，其裂果率可達50%～80%；紅棗的優質率較低，殘、次、落果率較高[2]。在臨近收獲期如遇到連陰雨天氣，會在很短時間內產生大批的裂棗和落果[2]。鮮棗的加工利用基本都是優質棗，大多通過干燥制成商品進入市場，優質干棗價格較高。殘次鮮棗往往由于商品價值低，未能及時有效處理而變成了農業廢棄物。

而殘次棗和優質棗同樣具有含糖量高的優點，開發天然發酵食品極具優勢[3-4]。李藝偉等[5]以殘次干紅棗為原料，經加水浸提制得棗汁，利用棗汁培養可食性酵母菌生產風味型酵母味素作為食品調味劑，為提高殘次紅棗加工利用率提供了思路。張寶善等[6]以陜北殘次干棗為原料，研究不同發酵方式對紅棗醋品質、生產周期以及生產自動化程度等方面的影響，為殘次紅棗加工棗醋的可行性提供理論依據。可以看出，目前利用殘次棗加工發酵食品基本上是先將殘次棗干制后再加水制汁發酵或帶皮渣發酵。但是干制需要消耗大量熱量，同時也會加重鮮棗中營養、保健成分的破壞[7]。殘次棗如果能以鮮棗形式大批量、快速加工生產棗產品，將會節約大量能源，并能減少紅棗資源浪費。

楊建紅等[8]以鮮紅棗為原料，用植物乳桿菌與酵母協同完成酒精發酵，接種醋酸菌后搖床培養發酵制得棗醋樣品，對鮮棗直接發酵果醋進行了有益嘗試。但是，這些研究的鮮棗處理量非常小，僅限于實驗室研究。本研究以河南新鄭棗區的殘次鮮棗為原料，采用半自動連續發酵生產棗醋，探討利用殘次鮮棗快速發酵生產優質棗醋的可行性，以期為殘次鮮棗的快速處置和資源化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殘次鮮棗：采自新鄭市孟莊鎮；

酵母菌：湖北安琪酵母股份有限公司；

醋酸菌：上海中科伍佰豪生物有限公司；

有機酸標品(蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等)：天津科密歐化學試劑有限公司；

3,5-二硝基水楊酸、2,4-二硝基苯肼、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸等：分析純。

1.2 儀器與設備

分光光度計：UV-2350型，優尼科(上海)儀器有限公司；

離心機：TGL-20M型，湖南湘儀離心機儀器有限公司；

榨汁機：ZJ145型，廣東恒聯食品機械有限公司；

液體發酵罐：HND-GQ-4.5型，鎮江匯能達生物工程設備有限公司；

高效液相色譜儀：LC-15C型，CTO-15C 柱溫箱，LC-15C泵，SIL-10AF 自動進樣器，SPD-15C紫外檢測器，島津中國有限公司；

色譜柱：Wondasil C18，4.6 mm × 250 mm，5 μm，島津中國有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 總可溶性固形物(TSS)、pH值、酒精、總酸以及水分含量測定 樣品TSS用手持糖度計測定；pH值用pH計法；發酵液酒精度用酒精計法；總酸采用酸堿滴定法測定；水分含量按GB 5009.3—2010執行。

1.3.2 總VC以及還原糖含量測定 總VC用2,4-二硝基苯肼法，按GB/T 5009.86—2003執行；標準曲線回歸方程為：y=0.025 1x+0.001 4，R2=0.995 5，樣品測定與計算參照GB/T 5009.86—2003。還原糖以3,5-二硝基水楊酸比色法測定[9]，以葡萄糖為標準物，標準曲線回歸方程為：y=0.442 7x-0.016 3(R2=0.991 2)；樣品按標準曲線方法測試與計算還原糖含量。

1.3.3 有機酸含量測定 采用RP-HPLC法[10]。流動相：0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH 2.8)；流速：0.7 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：210 nm；樣品處理：樣品迅速離心(4 ℃，10 000 r/min，20 min)后上機分析，外標法定量。

1.4 酒精發酵工藝

1.4.1 工藝流程

1.4.2 工藝要點 將運回實驗室的殘次紅棗參考拐棗預處理和酒精發酵的方法進行[10]。原料用水清洗，瀝干、稱重，按棗重加入1.5倍的飲用水，破碎打漿，漿液連同果渣一起轉入不銹鋼罐中，添加0.1%的活性干酵母混勻，常溫(約17 ℃)發酵，每12 h取樣，分析檢測發酵體系溫度、發酵液TSS、酒精度、還原糖含量以及pH值。

1.5 半自動連續醋酸發酵工藝

1.5.1 工藝流程

1.5.2 工藝要點 醋酸菌按10%的比例接種，維持發酵溫度34 ℃，以150 L/h通氣進行醋酸發酵。每12 h取樣分析發酵液酒精度和總酸度，當酸度不再升高說明第一批醋酸發酵完成。后續棗酒液的醋化采用半自動連續醋酸發酵法：取出一半棗醋后補充等體積棗酒液繼續第二批次醋酸發酵(分割留種發酵)，每6 h取樣分析；第二批棗醋發酵完成后，再以相同方法完成下一批次，直到發酵生產完成[11]。發酵生產過程中，通過分析發酵周期、發酵液酸度變化，監測判斷醋酸菌菌種的活力及傳代穩定性。

1.6 統計分析

2 結果與分析

2.1 殘次鮮棗的營養與利用價值

在新鄭市孟莊鎮紅棗產區收集生長成熟開裂的鮮棗、落地棗和次等鮮棗，以優質鮮棗為對照，檢測其水分、VC、還原糖以及總可溶性固形物含量，結果見表1。

表1 殘次鮮棗與優質鮮棗主要營養成分對比?Table 1 Comparision of the main nutritional components between inferior jujube and high quality jujube

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

紅棗中的糖分含量豐富，是重要的營養和風味成分[12]。鮮棗的含水量高，容易腐爛變質，需要及時有效處理；落地棗的還原糖和VC含量顯著低于優質棗和開裂棗(P<0.05)，低等級鮮棗還原糖和VC含量低于優質棗，但差異不顯著(P>0.05)。由表1可知，次等鮮棗、開裂鮮棗與優質鮮棗相比在主要營養成分含量上并無明顯差異。殘次鮮棗原料營養豐富，尤其是含糖量較高，因此發酵生產棗醋不用外加碳源及其它營養物質，開發純天然棗醋產品極具優勢。

2.2 殘次鮮棗酒精發酵

殘次鮮棗經前處理后接種果酒酵母進行常溫發酵，酒精發酵過程中發酵液品溫、TSS、酒精度、還原糖含量以及pH值變化見圖1。

同一條線上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖1 酒精發酵過程動力學變化Figure 1 Time course of alcoholic fermentation for jujube vinegar (n=3)

在初始階段(0～12 h)，由于酵母菌的不斷活動，發酵體系溫度開始略有升高。可以看出，即使在相對較低的常溫條件下(紅棗成熟季節)，棗漿的酒精發酵啟動很快；可能是紅棗原料營養全面、酸甜適宜，非常利于果酒酵母生長繁殖。在此條件下，酵母菌快速進行有氧增殖，發酵體系可以在較短的時間內處于厭氧狀態，這樣有利于抑制有害雜菌的活動。酵母將紅棗原料中含有的蔗糖轉化為葡萄糖和果糖[13]，同時還可能因為果渣中部分可溶性糖逐漸溶出，發酵初期的還原糖含量未見減少反而顯著升高，同時發酵液TSS略有上升。另外，發酵體系中可以觀察到開始產生大量細膩的氣泡和酒帽。主發酵階段(12～60 h)，發酵液體系溫度顯著升高(最高為20.5 ℃)；總可溶性固形物顯著下降；酒精度顯著升高，酒度達到7.91%Vol。最后，發酵活動逐漸減弱，發酵液體系溫度恢復至室溫，最終酒精含量為8.07%Vol，酒精發酵結束。

2.3 棗醋醋酸發酵

傳統醋酸發酵周期往往在1個月以上，主要是醋酸發酵的啟動較困難，通常比循環醋化周期更長，分割留種發酵法可以顯著提高醋化效率[14-15]。本研究采用半自動連續醋酸發酵法，圖2是第一輪醋酸發酵過程中酒精度、總酸含量以及pH變化。

同一條線上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖2 第一批醋酸發酵動力學變化Figure 2 Time course of the first cycle of acetic fermentation for jujube vinegar (n=3)

醋酸發酵初期(0～12 h)：經過活化、擴大培養的醋酸菌不斷增殖，這一階段發酵液酒精度小幅下降、總酸度開始升高，說明菌種生長繁殖良好。醋化階段(12～60 h)：發酵液酒精度從7.29%Vol快速下降至0.6%Vol，總酸含量從0.79 g/100 mL 顯著升高至4.63 g/100 mL，pH也顯著下降至最低(3.37)；這是醋化產酸的主要階段。最后，棗醋總酸度達到4.88 g/100 mL。為了保證分割留種發酵中菌種活力，第一批發酵應在60 h左右結束，補充紅棗酒液進行分割留種發酵。

采用分割留種發酵方式，進行了10個批次的醋酸發酵，發酵過程中酒精度和總酸含量變化見圖3，醋化過程明顯縮短。0～6 h為醋酸菌的增殖階段，為后期快速產酸做好準備。分割留種發酵初期由于菌體濃度較高，增殖過程縮短。6～30 h為快速產酸階段，發酵液酒精被轉化，伴隨著總酸顯著升高(P<0.05)。醋酸發酵最后，為防止過度發酵應及時補充紅棗酒液。

同一條線上不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖3 分割留種醋酸發酵動力學變化Figure 3 Time course of the cycle of acetic fermentation for jujube vinegar (n=3)

為保證菌種良好的醋酸發酵活力，避免過度發酵，在后期的分割留種醋酸發酵中以30 h為發酵周期。可以看出，10個批次的分割留種醋酸發酵規律基本一致，各批次所得的棗醋總酸度為4.48～5.05 g/100 mL，總酸度基本相當，平均值4.81 g/100 mL，變異系數0.15%。說明采用半自動連續醋酸發酵法可以穩定、快速進行紅棗醋生產。

2.4 棗醋有機酸分析

采用RP-HPLC法分析鮮棗棗醋中的主要有機酸，標準品色譜圖見圖4。

紅棗原料含有較為豐富的有機酸，有機酸是其重要的營養和風味成分。馬倩倩等[16]采用HPLC法分析棗果中的有機酸，檢出了草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸和抗壞血酸共7種有機酸，其中含量較高的為蘋果酸、檸檬酸和酒石酸。紅棗醋中共檢出10種有機酸見圖5，殘次鮮棗果醋和優質鮮棗果醋中各種有機酸含量見表2。紅棗醋醋酸含量最高，殘次棗果醋為4 399.52 mg/100 mL，優質棗果醋為4 467.06 mg/100 mL。其次是乳酸，殘次棗果醋為121.81 mg/100 mL，優質棗果醋為117.93 mg/100 mL。2個果醋樣品中含量較高的有機酸還有蘋果酸，殘次棗果醋蘋果酸含量為101.26 mg/100 mL，優質棗果醋為112.12 mg/100 mL；其它有機酸含量較低。

峰1.草酸 峰2.酒石酸 峰3.甲酸 峰4.蘋果酸 峰5.α-酮戊二酸 峰6.抗壞血酸 峰7.乳酸 峰8.醋酸 峰9.檸檬酸 峰10.富馬酸 峰11.琥珀酸

圖4 11種有機酸標樣色譜圖
Figure 4 Chromatogram of eleven organic acids from a standard mixture

峰1.草酸 峰3.酒石酸 峰4.甲酸 峰6.蘋果酸 峰7.α-酮戊二酸 峰8.乳酸 峰10.醋酸 峰11.檸檬酸 峰12.富馬酸 峰13.琥珀酸

圖5 紅棗醋有機酸色譜圖
Figure 5 Chromatogram of ten organic acids from jujube vinegar

酒精發酵過程中常常伴有蘋果-乳酸發酵(MLF)或者蘋果酸-酒精發酵(MEF)[17-18]。在MLF中，乳酸菌能將蘋果酸轉化成乳酸和CO2[19]。鮮棗棗醋中含有較高的乳酸，說明殘次鮮棗在酒精發酵過程中存在有效的蘋果-乳酸發酵，增加了棗醋中非揮發酸含量，對棗醋柔和而豐富厚重的酸感有積極作用。抗壞血酸是果品原料中抗氧化物質之一，在保藏以及打漿破碎、加熱等過程中通常不穩定[20-21]。紅棗中含量較高的抗壞血酸在2個紅棗醋樣中均未檢出。盡管紅棗中VC含量豐富，原料經過破碎、發酵等不同過程處理后還原型VC已逐漸氧化甚至降解消失。趙松等[22]以棗渣和大米為原料釀制棗醋，研究了不同發酵方法對棗醋有機酸的影響，共檢出醋酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等8種有機酸，主要有機酸組成和含量與本研究結果基本一致。

表2 紅棗醋有機酸含量Table 2 Contents of organic acids in the jujube vinegar mg/100 mL

3 結論

相比優質紅棗，殘次鮮棗的商品價值和利用程度低。但其營養成分可媲美優質鮮棗，是一種可發酵利用的農業廢棄資源。殘次鮮棗加1.5倍水破碎打漿，直接接種0.1%的果酒干酵母于采收季節常溫發酵72 h可得酒度為8.07%Vol的紅棗酒液。棗酒液接種10%的活化醋酸菌菌種，經過60 h可完成第一批醋酸發酵，棗醋酸度可達4.88 g/100 mL；進行10批次半自動連續醋酸發酵，發酵周期為30 h，制得紅棗醋平均酸度為4.81 g/100 mL；殘次鮮棗各批次醋酸發酵過程穩定，最終產品酸度穩定。

利用殘次鮮棗發酵生產的果醋中共檢出10種有機酸，主要為醋酸、乳酸和蘋果酸；其有機酸組成、含量與優質鮮棗果醋無明顯差異。以殘次鮮棗為原料通過半自動連續醋酸發酵法能高效生產紅棗醋，品質與優質鮮棗果醋相當，表明該方法可用于棗產區轉化殘次鮮棗資源生產鮮棗果醋。

[1] 閆忠心, 魯周明, 劉坤, 等.我國紅棗資源加工利用研究現狀與展望[J].西北農林科技大學學報： 自然科學版, 2010, 38(6): 102-108.

[2] 李鴻德, 任憲中.紅棗裂果病的發生及預防[J].西北園藝, 2007(6): 23.

[3] GAO Han, LIU Ben-guo, FU Shu-fang.Research on domestication process of lactic acid bacteria for jujube beverage by response surface[J].Methodology Advanced Materials Rese-arch, 2011, 271-273: 569-572.

[4] CHUN M S, KIM S J, NOH B S.Analysis of free amino acids and flavors in fermented jujube wine by HPLC and GC/MS[J].Korean Journal of Food Science and Technology, 2012, 44(6): 779-784.

[5] 李藝偉, 張寶善, 董婷婷, 等.利用殘次紅棗生產風味型酵母味素的工藝研究[J].西北農林科技大學學報: 自然科學版, 2015, 43(4): 163-169.

[6] 張寶善, 陳錦屏, 李冬梅, 等.利用次等紅棗生產果醋的工藝研究[J].農業工程學報, 2004, 20(2): 213-215.

[7] GUO Sheng, DUAN Jin-ao, ZHANG Ying, et al.Contents changes of triterpenic acids, nucleosides, nucleobases, and saccharides in jujube (Ziziphus jujuba) fruit during the drying and steaming process[J].Molecules, 2015, 20(12): 22 329-22 340.

[8] 楊建紅, 張惠玲, 張衛峰.多菌混合發酵鮮棗果醋的工藝研究[J].中國釀造, 2015, 34(8): 155-158.

[9] MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for the determination of reducing sugar[J].Analytical Chemistry, 1959, 31(3): 426-428.

[10] XIANG Jin-le, ZHU Wen-xue, HAN Jun-qi, et al.Analysis of organic acids in Chinese raisin tree (Hovenia dulcis) peduncle and their changes in liquid fermentation process[J].Food Science and Biotechnology, 2012, 21(4): 1 119-1 127.

[11] 向進樂, 杜琳, 李欣, 等.拐棗醋半固態-液態發酵工藝研究[J].現代食品科技, 2014, 30(7): 160-164.

[12] 孫濤, 趙子剛, 劉圣紅, 等.高效液相色譜法測定鮮棗中糖的組成[J].分析儀器, 2015(1): 38-41.

[13] JAYABALAN R, MARIMUTHU S, SWAMINATHAN K.Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation[J].Food Chemistry, 2007, 102(1): 392-398.

[14] TESFAYE W, MORALES M, GARCIA-PARRILLA M, et al.Optimising wine vinegar production: fermentation and ageing[J].Applied Biotechnology, Food Science and Policy, 2003, 1(2): 1-6.

[15] KAUR P, KOCHER G, PHUTELA R.Production of tea vinegar by batch and semicontinuous fermentation[J].Journal of Food Science and Technology, 2011, 48(6): 755-758.

[16] 馬倩倩, 吳翠云, 蒲小秋, 等.高效液相色譜法同時測定棗果實中的有機酸和VC含量[J].食品科學, 2016, 37(14): 149-153.

[17] VERSAARI A, PARPINELLO G, CATTANEO M.Leuconostocoenosand malolactic fermentation in wine: a review[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 1999, 23(6): 447-455.

[18] VOLSCHENK H, VUUREN H, VILJOEN-BLOOM M.Malic acid in wine: Origin, function and metabolism during vinification[J].South African Journal for Enology & Viticulture, 2006, 27(2): 123-135.

[19] REDZEPOVIC S, ORLIC S, MAJDAK A, et al.Differential malic acid degradation by selected strains of Saccharomyces during alcoholic fermentation[J].International Journal of Food Microbiology, 2003, 83(1): 49-61.

[20] BHATTACHERJEE A, TANDON D, DIKSHIT A, et al.Effect of pasteurization temperature on quality of aonla juice during storage[J].Journal of Food Science and Technology, 2011, 48(3): 269-273.

[21] PAREEK S, PALIWAL R, MUKHERJEE S.Effect of juice extraction methods and processing temperature-time on juice quality of Nagpur mandarin (Citrus reticulata Blanco) during storage[J].Journal of Food Science and Technology, 2010, 48(2): 197-203.

[22] 趙松, 王頡, 劉亞瓊.不同發酵方法對棗醋主要有機酸含量的影響[J].中國食品學報, 2014, 14(3): 135-139.