可吸收膠原膜的體內免疫反應評價

張林， 孫磊， 徐夢浛， 牛旭鋒

(北京航空航天大學 生物與醫學工程學院, 北京 100083)

引導組織再生術(Guided Tissue Regeneration, GTR)常用于牙周修復，主要是在傷口處使用一種閉塞膜形成一種物理屏障，阻止牙結締組織向牙根面生長，為牙周膜、牙骨質和牙槽骨的修復提供空間和時間。GTR已經被提出作為根管治療的輔助手段來促進骨再生[1]，并且使用GTR以促進牙周再生已經取得了滿意的結果[2]，尤其在較嚴重的根尖周病變和貫穿病變的情況下。目前的研究發現，使用可吸收的屏障材料比不可吸收的材料，或者不使用屏障材料的效果要好[1]。理想的屏障材料需滿足以下幾個條件：生物相容的，能夠作為屏障防止其他細胞類型向根面生長，允許營養物質和空氣通過，允許組織整合進材料卻又不影響其防止內皮細胞向下生長的功能，提供并維持一個靠近根面的空間，具有便于加工的結構等[1]。

膠原已經被用于骨修復，不僅因為它是骨基質的主要成分，具有良好的生物相容性和生物降解性，無細胞毒性，較低的免疫原性，易被加工成為不同的形式[3]。此外，膠原還是一種牙周膜成纖維細胞的趨化因子[4]，能夠阻擋內皮細胞的遷移，并且具有止血效應[5]。在膠原作為屏障材料的研究中都發現了牙再生的現象，并且5個月之后膠原全部降解[6]。可見，膠原作為引導膜治療牙周病具有一定的優勢，是一種較理想的材料，所以用于牙修復的膠原膜被廣泛研究，但是其能否成為廣泛應用的產品還得經過另一項檢測，也就是免疫學評價，因為免疫原性是產生免疫毒性的主要原因。

眾所周知，大多數膠原都來源于動物，因而提取的膠原中殘留動物蛋白、DNA、細胞是難以避免的。有研究表明，膠原的結構、殘留的非膠原蛋白和細胞、膠原的交聯方式等都會對膠原的免疫原性產生影響[7]。因此，為了病人的安全和產品的廣泛使用，進行免疫原性評價是十分必要的。

以往也有類似的研究，但是都不夠深入全面，大多都只是停留在炎癥的研究，而組織學檢驗和抗體檢測是使用最廣泛的評價方法[8-10]。在本實驗中對豬來源的2種骨導膜進行了免疫學評價，希望為其廣泛的應用于臨床奠定基礎。本實驗制定了一套較完整的免疫原性檢測方案，通過將其植入到BALB/c小鼠皮下，定期取樣檢測來分析膠原膜引起的免疫應答反應，檢測指標涵蓋了細胞免疫和體液免疫，局部免疫和系統免疫，免疫器官、免疫細胞和免疫分子，對膠原膜的臨床應用具有重要意義。

1 實 驗

1.1 動物與材料

動物實驗已經獲得了北京大學生物醫學倫理委員會的批準，并嚴格按照其規定來飼養動物。本實驗共需要20只6～8周，體重20 g左右的雌性BALB/c小鼠。實驗共分為4組，每組5只，包括2個實驗組(S1和S2，分別植入膠原膜1和膠原膜2)，陽性對照組(PC，植入豬皮)，陰性對照組(NC，只做手術，不植入)。材料由深圳蘭度生物材料有限公司提供。

1.2 皮下植入

以50 mg/kg的比例腹腔注射w/v分數0.5%的戊巴比妥鈉生理鹽水溶液麻醉小鼠，待小鼠昏迷之后，選取一塊背部脊柱兩側的皮膚，脫毛并用體積分數75%酒精消毒，用無菌手術剪剪開一個約1 cm的傷口并撐開皮膚，放入材料，縫合傷口(NC組不植入直接縫合)。總共在每只老鼠背部3個不同位置皮下植入各1次，一周一次。

1.3 取 樣

1.3.1 取 血

分別在3次植入后第3天和第7天，分別剪去約1 cm長度的尾尖取血，用EP管收集，待血液分層之后，10 000 r/min 離心5 min，收集上清液于另一干凈的EP管，標記，置于-20℃冰箱供檢測抗體。到第14天時，直接摘除一只眼球取血，后面的處理同上。

1.3.2 臟器處理

第14天取血之后，拉頸處死小鼠，無菌環境下摘除脾和腋下淋巴結，浸泡于無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution, PBS)中。將脾臟研磨成單細胞懸液，800 r/min離心5 min，去上清，加入1 mL 紅細胞裂解液，室溫1 min，再加PBS至5 mL以終止反應，離心去上清，加入一定量 PBS懸浮細胞并混勻。取出少量稀釋到適當倍數，進行細胞計數。淋巴結也經過類似的處理，只是不需要加紅細胞裂解液，直接稀釋計數。

1.3.3 局部組織處理

剪下最后一次植入部位的皮膚和材料，浸泡于w/v分數4%多聚甲醛中固定，供組織學分析。

1.4 細胞表型和流式細胞術

用于脾細胞表型識別和篩選的5種熒光單克隆抗體分別是anti-CD19 PE-Cy7、anti-TCR APC、 anti-CD4 FITC、anti-CD8 PerCP、anti-Ki67 PE。將單細胞懸液加入2 mL尖底離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加冷PBS 1 mL，離心洗滌，棄上清液。加入用PBS稀釋的熒光素標記的抗體200 μL。用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育0.5～1 h。離心棄上清液，加入冷PBS 1 mL，離心洗滌2次, 以除去未結合的多余抗體成分。向細胞中加入冷PBS 500 μL，吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測[11-12]。

1.5 細胞增殖

按每孔2×105的細胞數量取得細胞，離心去上清，加入1640培養基(含體積分數10%胎牛血清，體積分數1%雙抗)200 μL，并按比例加入佛波酯(Phorbol-12-Myristate-13-Acetate, PMA)和離子霉素(Ionomycin, Iono)使之終濃度為100 ng/mL和1 000 ng/mL，混勻后加入96孔板，放入二氧化碳培養箱培養。48 h后用MTS試劑盒檢測細胞增殖情況，具體來說，取出孔板，小心吸出上層培養液，每孔加20 μL MTS和80 μL 1640培養液混合液，培養箱孵育1 h，用酶標儀測490 nm處的吸光度。

1.6 酶聯免疫吸附測試

用包被液以1∶1 000稀釋包被抗體，每個孔100 μL，4℃過夜孵育。倒去包被液，每孔加入200 μL PBST(體積分數0.05% 吐溫-20的PBS溶液)洗滌1 min，洗3次，用紗布包住拍干水分。加入200 μL PBSB(w/v分數1%牛血清白蛋白的PBS溶液)封閉液，室溫放置2 h后，傾去液體，拍干水分。加入稀釋好的樣品(IgG 1∶100 000，IgM 1∶10 000)以及標準品(IgG 1∶25 000，IgM1∶5 000)100 μL，并設置空白對照，室溫2 h。洗滌6次，拍干水分。辣根過氧化物酶標記的一抗用PBSB稀釋1 000倍，每孔加100 μL，室溫2 h，洗滌6次，拍干。加100 μL 3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺，黑暗孵育10 min(IgM)/20 min(IgG)后，加50 μL終止液(2 mol/L硫酸溶液)，450 nm測吸光度[13]。

1.7 H&E

如文獻[14]所述，皮膚組織經過w/v分數4%多聚甲醛固定之后，經過水洗，酒精梯度脫水，透明，石蠟包埋。石蠟塊被切成3～5 μm的薄片，置于載玻片上，脫蠟之后再進行H&E染色，按標準步驟進行。

1.8 數據處理

所有數據都是由至少3個平行樣本得出的，數據顯示為mean±SD (均值±標準差)，作圖是采用GraphPad Prism軟件，數據分析采用單因素方差分析，當*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005時，差異被視為具有統計學意義，文中所有比較都是與NC組比。

2 結果與討論

2.1 免疫器官及細胞計數

脾和淋巴結是淋巴細胞的主要棲息地，也是免疫反應發生的主要場所，因此觀察脾和淋巴結的大小以及其中的免疫細胞數目能從一定程度上反映免疫反應的強弱。圖1所示為3次免疫后第14天時小鼠的脾和淋巴結的形態，可以看到S1和S2組的脾和淋巴結與正常的脾和淋巴結對比，都沒有表現出明顯的大小變化，而PC組的脾出現了劇烈的膨大，比NC組的2倍還大，淋巴結也明顯較大。脾細胞計數結果見圖2(a)，2個實驗組的脾細胞數約為2×108，稍高于NC組的1×108，但差異無統計學意義。而PC組細胞數目也正如看到的急劇膨大的脾一樣，遠遠高于NC組，約4.7×108。淋巴結細胞數目見圖2(b)，無論是PC組還是2個試驗組，都與NC組的差異無統計意義，但是也能看到PC的淋巴結中的細胞數目(約8.5×107)高于其他組，約是NC組(約2.8×107)的3倍。無論是免疫器官還是其中的免疫細胞數目，結果都基本一致，即2種膠原膜對小鼠的免疫刺激都較小。

圖1 脾和淋巴結形態Fig.1 Images of spleen and lymph nodes

圖2 脾和淋巴結的免疫細胞計數結果(***p<0.005)Fig.2 Immune cell population of spleen and lymph nodes (***p<0.005)

2.2 脾淋巴細胞表型

正常脾淋巴細胞中T細胞約占 40%，B細胞占60%，CD4/CD8=2∶1。CD4+T細胞與CD8+T細胞的比值變化能從一定程度上反應機體的免疫功能狀態。本實驗分析了脾淋巴細胞的表型，每個組有3個平行樣本，規律類似，代表性流式圖如圖3所示，圖中比例表示對應類別細胞占總測試細胞的比例。由圖3可得到各組脾淋巴細胞中CD4+T細胞、CD8+T細胞和B細胞的含量百分比。對比試驗組和對照組結果可以得出，S2組的脾細胞組成比例正常，與 NC 組無明顯差異；S1組中，脾內 T細胞比例減少了約13%，B細胞比例輕微增多，但整體變化較PC組(T細胞比例與正常組比較下降了約22%，T、B細胞比例明顯失衡)明顯更小。且對比正常T細胞亞群CD4/CD8比例(約2.3)可知S1組和S2組CD4/CD8比例(分別為2.1和2.5)正常；而PC組CD4/CD8比偏低(約1.5)。由此實驗結果可初步得出結論，膠原膜1的植入會引起小鼠輕微的免疫應答反應，但未影響其免疫系統的正常機能；而膠原膜2對小鼠的影響極小。

2.3 脾淋巴細胞活化

T細胞的活化通過2個亞群CD4+細胞和CD8+細胞反映，B細胞的活化則通過CD19+細胞反映。本實驗對CD4+、CD8+和CD19+細胞表面的Ki67表達進行了檢測，因為Ki67是與細胞活化和增殖相關的分子。每個組有3個平行樣本，規律類似，代表性的流式分析圖如圖4所示。通過圖4可以看出，各組別的CD4+和CD8+T細胞的活化狀態無太大區別，但還是能看出PC組和S1組的CD4+T細胞活化相對較多，活化比例比NC組高出約5%；S1組和S2組的B細胞活化稍有增加，約為NC組(5.14%)的2倍，但S1(13.29%)多于S2(9.61%)，PC組B細胞明顯處于過度活躍狀態中，活化率高達19.64%，大約是NC組的4倍。這些結果表明植入膠原膜引起了適當的免疫細胞激活，即小鼠對膠原膜作出了輕微免疫反應，對比2種膠原膜，膠原膜1引起的反應更明顯。

圖3 流式細胞術分析脾淋巴細胞表型Fig.3 Splenic cells’ phenotype analysis by flow cytometry

2.4 淋巴細胞增殖

水溶性甲臜化合物(MTS)能被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的有色甲臜產物，生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。用酶標儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。淋巴細胞的增殖能力代表了其向淋巴母細胞的轉化情況，而淋巴母細胞的轉化率可以反映免疫反應水平。本實驗采用PMA和Iono體外刺激細胞增殖來檢測細胞的活化情況，結果如圖5所示,圖中“**”表示PC組和NC組的吸光度差異具有高度的統計學意義。植入膠原膜第14天之后的老鼠的脾細胞和淋巴結細胞，均沒有像PC組細胞那樣表現出顯著高于正常小鼠細胞的增殖能力，吸光度都在0.5左右，與正常小鼠的差異無統計學意義，也就是說明材料沒有刺激大量的免疫細胞活化，即免疫反應微弱。

2.5 血清中抗體水平

抗體是由漿細胞分泌的用來鑒別和中和外來抗原的物質，在體液免疫中起著重要的作用。本實驗檢測了血清中的IgM和IgG，二者分別在初次免疫應答和再次免疫應答中起作用，因此IgG產生較晚。酶聯免疫吸附測試結果顯示各組中IgM濃度沒有顯著差異(本文未給出)。對此分析這可能是因為在3次植入免疫中，第1次植入時機體免疫主要為初次免疫應答，IgM水平較高；隨著后續增強免疫的進行，機體免疫應答逐漸以再次免疫應答為主，初次免疫應答的水平逐漸減弱，故在3次免疫后第3天檢測時機體初次應答水平已經處于較弱階段，因此IgM濃度整體水平較低，故4組小鼠組間無明顯差異。IgG濃度的檢測結果如圖6所示，S1組的IgG濃度一直處于上升趨勢，但曲線斜率明顯小于PC組，S1組第14天血清中的IgG濃度(約12 mg/mL)約是NC組(約5.5 mg/mL)的2倍；而S2組的IgG濃度在第7天出現了輕微地上升，從4 mg/mL到8 mg/mL，第14天時與第7天差別不大。總體來說，2個實驗組與NC組的IgG濃度變化差異不大，尤其是S2組。Liu等[15]也有類似的發現，將豬源Ⅰ型膠原膜作為角膜原位移植到BALB/c小鼠后，在第14天的血清中也檢測到了IgG，并且濃度隨時間升高。而Patino等[16]的研究表明在Wistar大鼠的血清中沒有檢測到針對豬源膠原膜的抗體，這種差異可能是由于動物的種類不同而導致的。由此可見，本實驗中的豬來源的膠原膜1有可能對小鼠產生了一定的刺激作用，以至于小鼠體內產生了適當的IgG抗體來中和這種外來抗原，而膠原膜2對小鼠的刺激是不明顯的。

圖4 CD4+T細胞、CD8+T細胞和CD19+細胞的Ki67表達情況Fig.4 Ki67 expression of CD4+T lymphocytes，CD8+T lymphocytes and CD19+ lymphocytes

圖5 脾和淋巴結細胞體外增殖情況 (**p<0.01)Fig.5 Proliferation in vitro of splenic cells and lymph nodes cells (**p<0.01)

圖6 血清中IgG濃度隨時間的變化Fig.6 Variation of concentration of IgG in serum with time

2.6 細胞浸潤

以上的實驗都是針對系統性的免疫反應，細胞浸潤測試則是用來評價局部免疫反應。局部炎癥反應的一個特征是炎性細胞浸潤，因此在本實驗中筆者采用H&E染色來檢查植入局部的炎癥發生情況。代表性的H&E染色如圖7所示，M為植入的材料，右圖是左圖的局部放大。植入之后第14天，在PC組的組織中，大量的細胞聚集在整個材料之中，也就是說炎癥反應劇烈；與未植入的皮膚相比，在膠原膜1和膠原膜2的周圍有稍多的細胞浸潤，并且膠原膜1周圍的細胞數量多于膠原膜2，但都只是圍繞在材料周圍。這種現象與以往的研究結果一致，Liu等[15]的研究在植入后第12天也發現細胞浸潤現象只發生在膠原材料周圍，而沒有侵入其中。猜測可能是由于膠原本身的免疫原性比較低，以至于浸潤細胞少且細胞浸潤的速度慢。由此可見這2種材料會引起輕微的局部炎癥反應，并且膠原膜1引起的炎癥稍強于膠原膜2。

圖7 植入部位H&E染色Fig.7 H&E staining of implantation sites

本文實驗中的2種膠原膜唯一的差別在于膠原膜1是經過了過氧化氫滅菌處理，而膠原膜2沒有。過氧化氫是一種強氧化劑，其滅活微生物的原理是通過解離高活性的羥基，攻擊破壞微生物的細胞壁、DNA、脂類以及蛋白質等，對包膜病毒作用尤為明顯，生成產物只有水和氧氣，廣泛應用于生物醫藥領域[17-18]。本實驗中幾乎所有的結果都表明膠原膜1在BALB/c小鼠中引起的免疫反應明顯強于膠原膜2，推測主要原因是過氧化氫破壞了膠原的結構，使之抗原決定簇更多地暴露，從而增強了其免疫原性。有研究結果表明[19]，當過氧化氫濃度低于2%(體積分數)時，主要以氧化基團與膠原的交聯為主，而當過氧化氫濃度達到3%時，氧化能力變強，以至于破壞了膠原的結構，此時的作用以降解為主。

3 結 論

1) 本文提出了一套免疫原性檢測方案，可以用于檢測所有可植入生物材料的免疫原性，能為生物醫用材料的生物安全性檢測提供參考。

2) 膠原膜1在BALB/c小鼠中引起了輕微的系統性免疫反應，包括脾細胞數目和活化以及IgG抗體分泌增多，但是與未植入材料的老鼠無具有統計學意義的差異。另外，膠原膜1在植入局部引起了一定的細胞浸潤，即炎癥。

3) 膠原膜2在BALB/c小鼠中也引起了輕微的系統性免疫反應，主要是脾細胞數目增多，和B細胞活化增多，但是程度比膠原膜1要輕，還發生了反應程度比膠原膜1稍輕的局部炎癥。

4) 2種膠原膜在BALB/c小鼠中引起的免疫反應較弱，比NC組稍強，遠遠不及PC組，因此，這2種膠原膜，尤其是膠原膜2，可被認為是安全可靠的骨修復材料，能被應用于臨床試驗。

致謝感謝北京大學醫學部王巍老師在實驗中給予的指導與幫助，感謝谷歌生物科技有限公司給予技術支持。

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