人類皰疹病毒5型6型與扁平苔蘚相關(guān)性研究

王 君 陳官芝 管成飛 王瑩瑩

扁平苔蘚(lichen planus，LP)是一種慢性炎癥性皮膚病，常累及皮膚、甲、毛發(fā)和黏膜。皮膚扁平苔蘚(Cutaneous lichen planus, CLP)常侵犯四肢屈側(cè)皮膚。口腔扁平苔蘚(Oral LP，OLP)可以作為獨(dú)立的臨床癥狀出現(xiàn)，也可以伴發(fā)于皮膚扁平苔蘚或其他黏膜部位損害。LP的患病率約占人群的0.5%～2%，最常影響中年人(31～60歲)，男女發(fā)病率基本相等或女性稍多[1]。LP是一種自限性疾病，1個(gè)月～7年可消退。LP的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，有關(guān)病因包括自身免疫、感染(細(xì)菌或病毒)、代謝和遺傳等。近年來病毒因素在LP發(fā)病中的作用引起了很多學(xué)者的重視，LP與人乳頭瘤病毒(HPV)、肝炎病毒、人類皰疹病毒(HHV)等相關(guān)的研究均有報(bào)道。目前的研究相對(duì)集中于口腔扁平苔蘚，對(duì)皮膚扁平苔蘚的研究相對(duì)較少。本研究應(yīng)用Real Time PCR法檢測(cè)扁平苔蘚皮損組織及正常人皮膚組織中人類皰疹病毒5型6型的存在情況，探討此兩型病毒與扁平苔蘚發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科2016年5月至2017年7月期間經(jīng)組織病理檢查確診的20例扁平苔蘚患者皮損組織標(biāo)本，其中男9例，女11例，年齡23～62歲，平均(45.8±9.7)歲。另收集17名健康人美容外科手術(shù)正常皮膚組織，其中男8名，女9名，年齡25～58歲，平均(43.71±9.8)歲。兩組標(biāo)本性別和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有樣本保存于-80℃環(huán)境中。

1.2 試驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 DNA提取 取20例LP患者皮損及17名健康對(duì)照者皮膚組織(定量10 mg)，使用病毒DNA純化試劑盒(TaKaRa Code NO.9766，購自寶生物工程大連有限公司)，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟純化提取DNA。得到的DNA提取液置于-4℃環(huán)境中保存待用。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 采用Real Time PCR的Cycleave探針法。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 用EASY Dilution將構(gòu)建的DNA標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋作為模板進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1～4)。

1.2.2.3 樣本HHV-5及HHV-6定量DNA檢測(cè) 采用Real Time PCR檢測(cè)樣本，記錄Ct值，計(jì)算HHV-5及HHV-6 DNA拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。扁平苔蘚組與對(duì)照組病毒檢測(cè)陽性率比較采用Fisher確切概率法(Fisher exact probability test)。兩組樣本陽性標(biāo)本的DNA拷貝數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組所有樣品進(jìn)行HHV5基因檢測(cè)時(shí)均沒有擴(kuò)增。20例扁平苔蘚皮損組織樣本中有16例(16/20,80%)HHV-6DNA擴(kuò)增，17名健康人皮膚組織中有9名(9/17,52.94%)HHV-6DNA擴(kuò)增，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，兩組樣本HHV-6陽性率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。兩組中HHV-6陽性標(biāo)本的DNA濃度(拷貝數(shù))間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

圖1 HHV-5定量反應(yīng)曲線

圖2 HHV-5定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 HHV-6定量反應(yīng)曲線

圖4 HHV-6定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 HHV-6實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組陽性例數(shù)的組間比較

注：Fisher確切概率法(Fisher exact probability test)P>0.05

表2 兩組中HHV-6陽性樣本的DNA拷貝情況

注：t=0.509，P>0.05

3 討論

人類皰疹病毒5型(Human Herpesvirus 5, HHV-5，巨細(xì)胞病毒Cytomegalovirus，CMV)是DNA病毒，在人群中感染非常普遍，普通成人中45%～50%曾被HHV-5感染，幼年生活在貧困地區(qū)的人感染率甚至可以達(dá)到100%[2]。但大多數(shù)呈臨床不顯性感染或潛伏感染，單核細(xì)胞是HHV-5潛伏的載體之一[3]，HHV-5有嗜腺體細(xì)胞性，唾液是病毒釋放傳播的途徑。人類皰疹病毒6型(Human Herpesvirus 6,HHV-6)是1986年從艾滋病合并淋巴細(xì)胞增生性疾病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離出的一種病毒。與其他皰疹病毒相似，急性感染恢復(fù)后，病毒可長期潛伏在體內(nèi)，一旦機(jī)體免疫力降低，病毒可激活致病。HHV-6是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一種可以將其DNA整合至宿主細(xì)胞染色體上的皰疹病毒。病毒可分為HHV-6A和HHV-6B兩型。HHV-6B的感染呈全球分布，據(jù)估計(jì)2歲以上人群的HHV-6抗體陽性率>95%[4]。在體外培養(yǎng)中，HHV-6可以感染T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、NK細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。

HHV-5及HHV-6的感染或再激活與許多疾病相關(guān)聯(lián)。有學(xué)者對(duì)HHV-5及HHV-6與口腔扁平苔蘚做了相關(guān)研究，結(jié)論尚有爭(zhēng)議。Ghodratnama等[5]在OLP患者黏膜組織中檢測(cè)到HHV-5DNA(2/20)、HHV-6DNA(4/20)及HHV-5、6DNA共同陽性，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能確定與OLP的發(fā)病有關(guān)聯(lián)。顧楊等檢測(cè)了OLP患者及健康對(duì)照者的不同標(biāo)本中4種人類皰疹病毒DNA,發(fā)現(xiàn)HHV-5與OLP的發(fā)病相關(guān)聯(lián)，但HHV-6、HHV-7與OLP的發(fā)病關(guān)系不能確定[6]。人類皰疹病毒與皮膚扁平苔蘚(CLP)的關(guān)系研究較少，Nahidi等[7]的研究認(rèn)為HHV-7與LP的發(fā)病相關(guān)。

在我們的研究中，所有組織樣本均未檢測(cè)到HHV-5DNA,推測(cè)扁平苔蘚的發(fā)病與HHV-5的局部感染無關(guān)。與顧楊等[6]對(duì)OLP的研究結(jié)果不一致，考慮可能的原因有：1)皮膚樣本DNA含量較低；2)HHV-5病毒不在皮膚組織中感染復(fù)制；3)HHV-5有嗜腺體細(xì)胞性，可能OLP與CLP在發(fā)病機(jī)制上存在不同的誘發(fā)因素。20例扁平苔蘚皮損樣本中有16例(16/20,80%)HHV-6DNA擴(kuò)增，17名健康人皮膚組織中有9名(9/17,52.94%)HHV-6DNA擴(kuò)增，CLP組陽性率高于健康對(duì)照組，但兩組樣本HHV-6陽性率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Ghodratnama等[5]的研究結(jié)果類似。扁平苔蘚是一種病因復(fù)雜的免疫相關(guān)性疾病，誘發(fā)因素很多。包括人類皰疹病毒在內(nèi)的很多感染因素在誘發(fā)扁平苔蘚發(fā)病過程中所扮演的角色有待進(jìn)一步研究。

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