副溶血弧菌與Hela細胞表面蛋白結合相關外膜蛋白的篩選和鑒定

王婧婷 ，陳 萌 ，李卓昱 ，袁增智 ，孫金生

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

副溶血弧菌是一種嗜鹽性革蘭氏陰性短桿菌，除了能夠感染海水甲殼類、貝類以及魚類等水生動物以外，其引發的人類胃腸炎已成為世界范圍內重要的公共衛生問題之一[1-2].

革蘭氏陰性菌的外膜由蛋白、糖和脂質構成，在細菌與宿主的相互關系中發揮著重要作用.外膜蛋白約占外膜全部成分的1/2，其數量和種類隨著菌種和培養條件的不同而有所差異[3].外膜蛋白作為外膜的主要組分，在細菌的生命活動中具有重要的生理功能.如富含β折疊結構的外膜蛋白A（OmpA），不但維持著外膜的完整性，而且還是不同噬菌體的受體[4].微孔蛋白（OmpC）以非共價鍵與肽聚糖緊密結合，形成了相對非特異性的通道，在對外界營養物質攝取、代謝物質運輸、物質合成方面起著重要作用.脂蛋白（Lpp）是含量最豐富的結構蛋白，具有穩定細菌外膜-肽聚糖復合體的功能[5].另外，某些病原菌外膜蛋白還具有黏附素的作用，有助于病原菌對宿主細胞的黏附[6-7].

由于病原菌的黏附作用與其致病性密切相關，因此探究VP外膜蛋白在菌體對宿主細胞進行侵染過程中的作用有助于闡明VP的致病機制[8].本研究通過VP外膜蛋白與Hela細胞表面蛋白的互作實驗，篩選出可與宿主細胞表面蛋白互作的一類VP外膜蛋白，研究其與宿主細胞的黏附作用，為進一步探究VP與宿主細胞的黏附作用機制提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

副溶血弧菌NY-172菌株，天津市水生動物疫病預防控制中心；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）菌株、Hela細胞株、pET-28a、pET-32M質粒，本實驗室保存.

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器

C1000 Touch PCR儀、GDS-8000凝膠成像儀、蛋白質電泳槽、核酸蛋白檢測儀，美國Bio-Rad公司.

1.2.2 試劑

Sal I和Xho I限制性內切酶，美國Takara公司；鎳柱，生工生物工程（上海）股份有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、胰酶，美國Thermo Fisher Scientific公司；同源同組試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；多聚組氨酸標簽單抗、HRP-標記羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗鼠二抗，天津三箭生物技術有限公司.

1.3 方法

1.3.1 Hela細胞表面蛋白的生物素化（biotin）標記

將在細胞瓶中長至單層的Hela細胞去除培養基，用PBS緩沖液清洗3次，加入預冷的PBS緩沖液，將細胞從瓶上輕輕刮下，置入15mL離心管中，離心收集細胞.用預冷的PBS緩沖液清洗細胞3次，洗后用PBS緩沖液細胞重懸至2.5×107mL-1.加入濃度為2 mmol/L的NHS-PEG4-biotin試劑，4℃孵育30 min.用PBS緩沖液清洗細胞3次，加入終濃度為100 mmol/L的甘氨酸終止液，于4℃顛倒混合15 min，終止后用PBS緩沖液離心清洗3次.取出1份細胞按體積比1∶250的比例加入FITC-Avidin試劑，于37℃孵育30 min，反應結束后用PBS緩沖液洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照保存.剩余細胞加入適量裂解液重懸，4℃下裂解30 min，之后4℃下以12 000 r/min的速率離心30 min，取上清液保存于-80℃.

1.3.2 與細胞表面蛋白結合相關的外膜蛋白的篩選

取2個自旋柱，用PBS緩沖液離心清洗，分別加入中性卵白素樹脂，4℃下500 r/min離心1 min.PBS緩沖液離心清洗樹脂3次，將含生物素化表面蛋白的Hela細胞蛋白樣品加入其中一個自旋柱，另一個自旋柱作為陰性對照加入PBS緩沖液，于室溫下顛倒混合15 min，多次上樣，每次上樣結束后于4℃下500 r/min離心1 min.之后用PBS緩沖液離心清洗樹脂1次，分別加入體積分數為0.02%的生物素封閉液封閉未結合蛋白的樹脂，于室溫下孵育15 min.孵育后離心除去封閉液，用PBS緩沖液離心清洗樹脂3次，在自旋柱中加入使用PMSF法提取的副溶血弧菌的外膜蛋白[9]，可多次重復上樣，每次上樣時于4℃下顛倒混合1 h.上樣結束后離心除去樣品，并用洗滌液離心清洗樹脂5次，最后用剛好沒過樹脂的洗脫液于室溫下孵育5 min，孵育后于4℃下500 r/min離心1 min，收集洗脫物.將洗脫物進行SDS-PAGE凝膠電泳分析并送至上海中科新生命公司進行蛋白質譜鑒定.

1.3.3 基因克隆、重組表達與純化

分析質譜鑒定結果，從NCBI獲取VP的Peptidase、PLP（PirA Like Protein）、OmpW、OmpN、Chaperonin 等基因序列，經THMHH以及SignalP 4.1在線預測跨膜區及信號肽.去除基因序列上的跨膜區、信號肽及終止密碼子后，設計引物，并在上、下游引物前分別添加一段15 bp左右的載體序列作為同源重組序列，設計的上、下游引物如表1所示.選取已報道的VP黏附因子——VpadF作為后續黏附因子鑒定時的陽性對照.

表1 引物序列Tab.1 Sequence of PCR primers

提取VP NY-172菌株基因組作為模板，使用表1中的引物分別擴增出以上蛋白的編碼序列，純化后使用同源重組連接試劑盒將其與線性化的載體PET-28a或PET-32M進行同源重組，得到PET-28a-Peptidase、PET-32M-OmpW、PET-32M-OmpN、PET-32M-PLP、PET-32M-Chaperonin重組質粒，經過菌落PCR驗證正確后，送樣測序.

挑選測序結果正確的克隆，將這些原核表達載體分別轉入BL21（DE3）感受態細胞，對其進行小量誘導表達，參照杜欣軍等[10]的方法對各個表達菌的表達條件進行優化，通過SDS-PAGE凝膠電泳確定各個重組蛋白的最佳誘導條件，之后進行大量表達并使用鎳柱進行親和純化.對上清液中表達的蛋白進行純化，之后通過透析將其緩沖液置換為PBS緩沖液；對包涵體中表達的重組蛋白則采取尿素梯度復性法進行復性，于PBS緩沖液中進行透析.

1.3.4 Western Blot驗證重組蛋白

取5 μg純化的重組蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后用轉膜儀將蛋白由PAGE膠轉印至PVDF膜.轉膜結束后，用去離子水洗去SDS，使用TBST緩沖液振蕩洗滌PVDF膜3次，每次5 min.使用質量分數為5%的脫脂奶粉TBST緩沖液作為封閉液，于4℃下封閉過夜.封閉后，用TBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次5 min，清洗后將PVDF膜與多聚組氨酸標簽單抗（稀釋比例為1∶1 000）于室溫下孵育2 h.孵育后用TBST緩沖液振蕩洗滌PVDF膜3次，每次5min，洗后將PVDF膜與HRP-標記羊抗鼠IgG（稀釋比例為1∶5 000）于室溫下孵育2 h.孵育后使用TBST緩沖液振蕩洗滌PVDF膜5次，每次10 min.在避光條件下加入新配置的HRP-底物顯色試劑，反應10 min，顯色完成后，使用去離子水沖洗PVDF膜以終止反應，掃描拍照.

1.3.5 間接免疫熒光分析

在12孔板中加入細胞爬片進行Hela細胞培養，當細胞生長密度約為80%時用PBS緩沖液清洗細胞3次，再向各孔分別加入100 μg重組蛋白或牛血清白蛋白（BSA），37℃下孵育1 h，加入PBS緩沖液的孔作為空白對照.孵育完成后每孔加入1mL體積分數為4%的多聚甲醛固定15 min，固定后用PBS緩沖液清洗細胞3次，向各孔中加入1 mL多聚組氨酸標簽單抗（稀釋比例為1∶500），37℃下孵育30 min.PBS緩沖液清洗3次，將異硫氰酸熒光素（稀釋比例為1∶1000）標記的羊抗鼠二抗加入細胞孔中，37℃下避光孵育30 min.在避光條件下，用PBS緩沖液清洗細胞5次，使用熒光顯微鏡觀察細胞表面的熒光，拍照保存.

2 結果與分析

2.1 Hela細胞表面蛋白的生物素化標記

由于Avidin可特異性結合biotin，為證明Hela細胞的表面蛋白已被成功地生物素化，將FITC-Avidin試劑與生物素化后的細胞進行孵育，并用FITC-Avidin試劑同樣處理未生物素化的Hela細胞作為對照組，觀察細胞表面熒光，結果如圖1所示.通過與對照組對比，證實Hela細胞的表面蛋白已經被成功地生物素化，可以進行Hela細胞蛋白的提取.

圖1 FITC-Avidin標記生物素化的Hela細胞Fig.1 Detection of biotinylated Hela cells by FITC-Avidin

2.2 VP與Hela細胞表面蛋白結合外膜蛋白的篩選

提取VP的外膜蛋白后，將生物素化修飾的Hela細胞的表面蛋白結合于中性卵白素樹脂上，作為誘餌蛋白垂釣VP外膜蛋白，洗脫物進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果發現，其中的蛋白分子質量主要在50～100 ku之間，如圖2所示.

圖2 SDS-PAGE分析洗脫蛋白Fig.2 Representative SDS-PAGE analysis of the eluted protein

對洗脫物進行質譜鑒定，共得到5個與Hela細胞表面蛋白黏附相關的VP外膜蛋白，質譜峰如圖3所示.

對5種蛋白的生物信息學分析結果如表2所示，這5種蛋白均為胞外蛋白，且OmpW和OmpN均在其他革蘭氏陰性菌中起到黏附宿主相關的作用.

2.3 重組蛋白的基因克隆、純化及Western Blot檢測

利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測純化后的重組蛋白，結果如圖4（a）所示，重組蛋白的條帶較單一，雜蛋白含量較少，說明各個重組蛋白純化成功.對重組蛋白進行Western Blot驗證，結果如圖4（b）所示，每種蛋白均與多聚組氨酸標簽抗體有較強的結合，但重組蛋白Chaperonin結合條帶的相對分子質量約為非重組蛋白相對分子質量的1/2，猜測Chaperonin蛋白可能發生了降解或解聚.

2.4 間接免疫熒光分析結果

為進一步驗證各候選蛋白的作用，利用間接免疫熒光實驗檢測重組蛋白黏附Hela細胞的能力，結果如圖5所示.

圖4 各重組蛋白的純化與檢測Fig.4 Representative SDS-PAGE analysis of purified recombinant proteins and Western Blot assay

由圖5可以看出，與陽性對照組VpadF結果相比，OmpW、OmpN、Peptidase、PLP、Chaperonin 組在Hela細胞表面的熒光更明顯，說明這5種重組蛋白均能與宿主細胞相結合.比較5種蛋白的細胞結合能力發現，OmpW、Chaperonin、Peptidase組的熒光強度均較強，表明這3種蛋白與Hela細胞的黏附作用很強，更可能為副溶血弧菌的潛在黏附因子；OmpN的熒光強度次之；PLP組的熒光強度最弱，即PLP與Hela細胞的黏附作用也最弱.

圖5 間接免疫熒光驗證各重組蛋白與Hela細胞間的相互作用Fig.5 Confirmation of the interaction between recombinant proteins and Hela cells by indirect immune-fluorescence assays

3 討論與結論

黏附作用對病原菌入侵宿主細胞具有重要意義[11]，外膜蛋白是革蘭氏陰性菌黏附因子的重要來源.本研究首次將生物素化的Hela細胞表面蛋白作為互作垂釣誘餌，通過親和層析的方法大規模垂釣并篩選鑒定副溶血弧菌可與宿主發生黏附的外膜蛋白，為規?；Y選鑒定副溶血弧菌的黏附因子奠定基礎.最終篩選出了5種可黏附Hela細胞表面蛋白的副溶血弧菌外膜蛋白，并對這些可能的黏附因子進行功能驗證.通過間接免疫熒光實驗，發現OmpW、OmpN、Peptidase、PLP、Chaperonin重組蛋白均可結合于Hela細胞的表面，說明這些蛋白均可能是VP黏附宿主細胞過程中重要的黏附素.Peptidase是相對分子質量約為45×103的肽酶，在蠟樣芽胞桿菌中發現其細胞壁中的Peptidase FM是一種黏附素，并對細胞具有一定的毒性[12].OmpW是一種常見的革蘭氏陰性菌外膜通道蛋白，在多種致病菌侵染宿主的過程中發揮重要作用.如霍亂弧菌的OmpW是一種黏附相關因子，與霍亂弧菌的侵襲力和毒力有關[13].在VP中，OmpW既是外膜通道蛋白，也是免疫原性蛋白.OmpN是一種外膜微孔蛋白，鮰愛德華氏菌的OmpN可與其免疫血清發生免疫反應，說明OmpN在鮰愛德華氏菌侵染宿主的過程中起到了重要作用[14].Chaperonin蛋白與大腸桿菌的GroEL蛋白具有較高同源性，位于菌體表面的GroEL蛋白有利于大腸桿菌黏附宿主的巨噬細胞，而表面具有GroEL的大腸桿菌也會導致小鼠更容易受到侵染并引起嚴重的腹膜炎[15].PLP是一種類似于PirA毒素的蛋白，熒光發光桿菌中的PirA毒素對多種昆蟲均具有口服殺蟲的活性，是該細菌一種重要的毒素蛋白[16]，因此PLP可能作為毒素蛋白通過黏附宿主的表面再發揮其毒素作用，其是否具有黏附因子的作用有待進一步研究.

綜上所述，本研究從VP中篩選并鑒定出了外膜蛋白 OmpW、OmpN、Peptidase、PLP、Chaperonin，是 VP菌潛在的黏附因子.該結果有助于進一步探索副溶血弧菌的致病機制，為后續預防與治療副溶血弧菌的感染奠定實驗基礎.

參考文獻：

[1]HARA-KUDO Y，KUMAGAI S.Impact of seafood regulations for Vibrio parahaemolyticus infection and verification by analyses of seafood contamination and infection[J].Epidemiology and Infection，2014，142（11）：2237-2247.

[2]CECCARELLI D，HASANNA，HUQ A，et al.Distribution and dynamics of epidemic and pandemic Vibrio parahaemolyticus virulence factors[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2013，3：97-106

[3] 陸盼盼，郭松林，關瑞章，等.致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究進展[J].生物技術通報，2014，30（4）：30-35.LU P P，GUO S L，GUAN R Z，et al.Review on the immunogenicity of pathogenic Vibrio outer membrane protein[J].Biotechnology Bulletin，2014，30（4）：30-35（in Chinese）.

[4]KHALID S，BOND P J，CARPENTER T，et al.OmpA：Gating and dynamics via molecular dynamics simulations[J].Biochimica et Biophysica Acta，2007，1778（9）：1871-1880.

[5] NGUYEN M T，G?TZ F.Lipoproteins of gram-positive bacteria：Key players in the immune response and virulence[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2016，80（3）：891-903.

[6] LITWIN C M，BYRNE B L.Cloning and characterization of an outer membrane protein of Vibrio vulnificus required for heme utilization：Regulation of expression and determination of the gene sequence[J].Infection&Immunity，1998，66（7）：3134-3141.

[7] AECKERSBERG F，LUPP C，FELICIANO B，et al.Vibrio fischeri outer membrane protein OmpU plays a role in normal symbiotic colonization[J].Journal of Bacteriology，2001，183（22）：6590-6597.

[8]GHENEM L，ELHADI N，ALZAHRANI FAISAL，et al.Vibrio parahaemolyticus：A review on distribution，pathogenesis，virulence determinants and epidemiology[J].Saudi Journal of Medicine and Medical Sciences，2017，5（2）：93-103.

[9] 閻斌倫，張曉君，秦國民，等.4種病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析[J].海洋科學，2012，36（5）：71-74.YAN B L，ZHANG X J，QIN G M，et al.Isolation and antigenicity analysis of outer membrane proteins from 4 Pathogenic vibrio sp.[J].Marine Sciences，2012，36（5）：71-74（in Chinese）.

[10]杜欣軍，王學連，李萍，等.金黃色葡萄球菌表面蛋白SdrD的原核表達及抗體制備[J].動物醫學進展，2015，36（3）：1-5.DU X J，WANG X L，LI P，et al.Prokaryotic expression and antibody preparation of SdrD surface protein of staphylococus aureus[J].Progress in Veterinary Medicine，2015，36（3）：1-5（in Chinese）.

[11]楊振泉，焦新安.副溶血弧菌毒力因子及其致病機理研究進展[J].中國人獸共患病學報，2008，24（11）：1070-1073.YANG Z Q，JIAO X A.Advances of study on infection mechanism and virulence factor of Vibrio parahaemolyticus[J].Chinese Journal of Zoonoses，2008，24（11）：1070-1073（in Chinese）.

[12]TRAN S L，GUILLEMET E，GOHAR M，et al.Cwpfm （entfm）is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion，biofilm formation，and virulence[J].Journal of Bacteriology，2010，192（10）：2638-2642.

[13]李建華.霍亂弧菌外膜蛋白W的原核表達及抗原性分析[J].軍事醫學，2011，35（10）：30-32.LI J H.Expression of Vibrio cholerae outer membrane protein W and identification of its antigenicity[J].Military Medicine Science，2011，35（10）：30-32（in Chinese）.

[14]潘延樂.鮰愛德華氏菌ompN基因的克隆及其原核表達產物對斑點叉尾鮰的保護效果評價[D].雅安：四川農業大學，2015.PAN Y L.Study on Cloning and Protective Efficacy of Recombinant Outer Membrane Protein N m（rOmpN）-based Vaccine of Edwarsiella ictaluri[D].Yaan：Sichuan Agricultural University，2015（in Chinese）.

[15]ZHU H Y，LEE C Y，ZHANG D M，et al.Surface-associated GroEL facilitates the adhesion of Escherichia coli to macrophages through lectinlikeoxidizedlow-densitylipoproteinreceptor-1[J].Microbes&Infection，2013，15（3）：172-180.

[16]孫建宇.熒光發光桿菌TT01菌株pirAB基因的克隆表達及殺蟲譜研究[D].廣州：中山大學，2012.SUN J Y.Cloning，Expression and Insecticidal Spectrum Analysis of the pirAB Gene from Photorhabdus luminescens TT01[D].Guangzhou：Sun Yat-Sen University，2012（in Chinese）.