豬Nhlh2基因啟動子活性及其表達調控的初步研究

溫麗娟，劉發偉，林長光，陳子韜，張 哲，張 豪，李加琪，袁曉龍*

(1. 華南農業大學動物科學學院，廣州 510642； 2. 福建光華百斯特生態農牧發展有限公司，三明 365106)

Nhlh2基因也稱為NSCL-2，該基因編碼的蛋白屬于堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子，由V.G?bel等[1]在1991年首次在小鼠胎腦cDNA文庫中篩選分離得到。研究表明，Nhlh2通過調控下丘腦GnRH的分泌，參與調控小鼠初情期的啟動[2-3]。與正常小鼠相比，Nhlh2突變導致下丘腦GnRH神經元數量減少50%，同時體內GnRH的濃度下降80%～90%[3-4]。Nhlh2敲除的小鼠在胚胎發育初期階段，GnRH神經元滯留在嗅覺/視前區，并表現出非正常性凋亡[5]。Nhlh2敲除的雌性小鼠，大部分卵泡在竇狀卵泡階段停止生長發育[4]，排卵數下降50%、發情間期延長及繁殖性能顯著下降[6]。此外，D.Nonneman等[7]通過全基因組關聯分析發現，與母豬初情期啟動失敗高度關聯的SNP位點位于Nhlh2基因附近。這些結果表明，Nhlh2可能參與調控哺乳動物卵泡的成熟、排卵及初情期啟動等繁殖活動。但是目前關于Nhlh2基因的表達調控機制仍不清楚。

本研究以豬卵巢基因組DNA為模板，以豬顆粒細胞為細胞模型，通過克隆豬Nhlh2基因的啟動子區域序列，構建不同缺失長度的報告基因系統，分析了該基因的啟動子活性，并研究了部分轉錄因子與該基因的表達調控關系。本研究能夠為后續母豬Nhlh2基因的結構和功能研究提供分子基礎，也為母豬繁殖機制的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

試驗于2016年5月至2017年4月在華南農業大學廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室完成。

1.1 試驗材料

試驗動物及相關組織：用于豬Nhlh2啟動子克隆的DNA模板樣品來自中山某豬場的長大二元雜交母豬的卵巢組織，豬卵巢顆粒細胞是用廣州市某屠宰場商品豬卵巢組織培養的原代細胞。

分子克隆試驗材料：基因組DNA抽提試劑、無內毒素質粒小量提取試劑、普通質粒小量提取試劑、凝膠回收試劑購自美國Magen公司，pMD-18T Vector、DNA A-Tailing Kit、PrimeStar HS、T4連接酶、限制性內切酶、10×Loading Buffer購自美國TaKaRa公司，Trans5α Chemically Competent Cell購自北京全式金有限公司，YY1 Antibody、C/EBPβ Antibody、GAPDH Antibody購自上海absin有限公司。

細胞培養與檢測試劑：培養基、青鏈霉素(雙抗溶液)購自Invitrogen公司，胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO，用于細胞轉染的Lipofectamine@3000購自美國Invitrogen公司，YY1-siRNA和C/EBPβ-siRNA由廣州銳博生物有限公司合成，pGL3-basic載體、pCDNA3.1載體、熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。其他均為常規化學試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬Nhlh2啟動子的克隆 根據NCBI基因數據庫中豬Nhlh2基因5′上游序列，設計合適的引物(表1)，使用PrimeStar HS高保真酶，以豬卵巢組織DNA為模板，PCR克隆擴增豬Nhlh2基因5′上游-3 565～+129 bp片段。PCR采用10 μL反應體系：5 μL PrimeSTAR HS，0.3 μmol·L-1上下游引物，0.3 μL DNA模板，ddH2O補足至10 μL。PCR反應條件：98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸4 min，共循環35次。PCR產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后回收加A尾，取4 μL產物加1 μL pMD18-T載體，16 ℃連接反應5 h，轉化大腸埃希菌DH5α，培養12 h，挑取單個菌落、擴增、測序。測序鑒定正確的質粒命名為T-Nhlh2。

1.2.2Nhlh2啟動子報告基因重組體的構建和序列分析 以測序鑒定正確的T-Nhlh2為模板，設計8條不同的上游引物，PCR擴增8條不同5′端的缺失片段(擴增引物見表1)，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，用MluI、XhoI雙酶切膠回收系列缺失片段PCR產物，同時pGL3-basic經MluI、XhoI雙酶切，定向連接，轉化大腸埃希菌DH5α，氨芐青霉素平板涂板后，培養過夜進行抗性篩選，陽性克隆經雙酶切鑒定正確后，命名為P1～P8。利用TFBIND[8]和JASPAR[9]等生物信息學網站預測分析目的片段存在的潛在轉錄因子結合位點。

1.2.3 轉錄因子YY1、C/EBPβ表達載體、突變體的構建 根據YY1、C/EBPβ基因的序列，分別設計引物(表1)，反應條件及體系按PrimeStar HS PCR說明書進行，YY1經NheI、XhoI雙酶切，C/EBPβ經KpnI、XhoI雙酶切，分別連接pCDNA3.1載體獲得pCDNA3.1-YY1、pCDNA3.1-C/EBPβ。以P7(-238～+129)為模板，根據重疊PCR原理，設計含有突變堿基的引物(表1)，構建YY1、C/EBPβ潛在結合位點突變的突變載體，命名為pGL3-P7-YY1-Mut、pGL3-P7- C/EBPβ-Mut。

1.2.4 豬卵巢顆粒細胞的培養及轉染 原代顆粒細胞的培養及傳代參考文獻[10-11]，待細胞匯合度約90%時，以2.5×105個·孔-1接種于24孔板，按照Invitrogen公司的Lipofectimine 3000轉染試劑盒說明書操作。每個試驗設置4個復孔，轉染后在無雙抗的10%胎牛血清DMEM培養基500 μL中培養6 h后更換為含有雙抗的10%胎牛血清DMEM培養基中繼續培養，在瞬時轉染細胞24 h后，用雙熒光素酶報告基因系統進行熒光素酶活性檢測，收集數據分析啟動子片段轉錄活性。

1.2.5 染色質免疫共沉淀(ChIP) ChIP試驗的操作流程參照文獻[12-13]，用終濃度為1%甲醛在37 ℃孵育細胞10 min，使蛋白與DNA交聯。用終濃度為0.125 mol·L-1的甘氨酸室溫處理5 min終止交聯。收集細胞后超聲破碎。10 000 ×g，4 ℃離心細胞液，收集上清。用特異性抗體與DNA結合蛋白結合，對應抗體為，陽性對照：Anti-RNA Polymerase II抗體；陰性對照：兔IgG抗體；試驗組：YY1或C/EBPβ特異性抗體，沉淀法分離復合體。反向交聯操作釋放出DNA，并消化蛋白質。PCR檢測Nhlh2啟動子-101～-85和-153～-140處片段，引物序列見表2。

表1引物列表

Table1Primersusedinthisstudy

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence產物大小/bpProductssizeP1-FCGACGCGTCGAGCCTTTGTAGTTCCACCAG3694P2-FCGACGCGTCGAAAACTGAGGTCCAGAAAGGT2677P3-FCGACGCGTCGGCACAGAAGGAAGACCCAT2150P4-FCGACGCGTCGGTGAGGGTAACTGTAGGTGT1686P5-FCGACGCGTCGGGTGGGGTAAGGCTGTAAT1173P6-FCGACGCGTCGACAGTGATCCCTGAAATTGC783P7-FCGACGCGTCGAGCTAAGGTTTCTATCGTGGA367P8-FCGACGCGTCGTCTCTTCCACCATCTCCAGG149RCCGCTCGAGCGGAAAGTGAATGTCTCCCGGAAYY1-FCTAGCTAGCTAGGCCTCGGGCGACACCC1174YY1-RCCGCTCGAGTCACTGGTTGTTTTTGGCCTC/EBPβ-FGGGGTACCATGCAACGCCTGGTGGCCT1041C/EBPβ-RCCGCTCGAGCTAGCAGTGGCCGGAGGAGGYY1-NFATTAAGTGACTCATGTAAGTTCTTCTGTCCAATAGGAYY1-NRTCCTATTGGACAGAAGAACTTACATGAGTCACTTAATC/EBPβ-NFAAATATTTGGGCTGTAGCCGATCCCACACTGTGACAC/EBPβ-NRTGTCACAGTGTGGGATCGGCTACAGCCCAAATATTT

下劃線為酶切位點，灰色部分為保護堿基，斜體加粗的堿基表示突變堿基

The underlines are the enzyme digestion sites; Grey parts indicate the protected sequencing bases; Bases in italic and bold represent the mutation bases

表2ChIP驗證引物信息

Table2PrimersusedinChIP

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence產物大小/bpProductssizeNhlh2(-118/-14)F:AGTCCAATTAAGTGACTCATGT105R:AGAGATAAAGGCTTAAGCAGGGNhlh2(-225/-112)F:TATCGTGGACTGCTTTCAACT114R:TTGGACTTGACATCTGTCACAGAPDHF:TACTAGCGGTTTTACGGGCG166R:TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA

1.2.6 統計分析 所有數據均用“平均值±標準差”表示，并經雙尾T-test檢驗差異是否具有統計學意義。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2 結 果

2.1 豬Nhlh2啟動子缺失片段報告基因重組質粒的構建和酶切鑒定

從豬卵巢基因組DNA中克隆獲得-3 565～+129(3 694 bp)的Nhlh2的5′端片段(圖1A)，并命名為T-Nhlh2。以T-Nhlh2為模板，設計8條不同的上游引物，PCR擴增出8條不同5′端的缺失片段(圖1B)，經瓊脂糖凝膠電泳分析驗證，擴增產物與預期片段大小相符(圖1C)。用限制性內切酶MluⅠ、XhoⅠ酶切這些5′端的缺失片段和雙熒光素酶載體后，構建了P1～P8報告基因系統重組質粒，并經雙酶切(圖1D)和測序鑒定。

A. Nhlh2啟動子擴增產物；B. Nhlh2啟動子5′端缺失片段長度圖示；C. Nhlh2啟動子5′端缺失片段擴增產物；D. Nhlh2啟動子5′端缺失片段的酶切鑒定。M. DNA相對分子質量標準；T. 3 694 bp(T-Nhlh2)；1～8. Nhlh2基因5′端逐段缺失擴增結果(-3 565～+129、-2 548～+129、-2 021～+129、-1 557～+129、-1 044～+129、-654～+129、-238～+129、-20～+129)；P1～P8. P1～P8載體的酶切鑒定A. Products of Nhlh2 promoter amplification; B. Length of Nhlh2 promoter 5′ fragments; C. Products of 5′ fragments of Nhlh2 promoter amplification; D. Identification of Nhlh2 promoter 5′ deletion fragments by restriction enzymes. M. DNA marker DL5000; T. 3 694 bp (T-Nhlh2); 1-8. The DNA bands of 5′ fragments of Nhlh2 gene unidirectional deletions (-3 565-+129, -2 548-+129,-2 021-+129, -1 557-+129, -1 044-+129,-654-+129,-238-+129, -20-+129); P1-P8. Identification of vectors P1-P8 by restriction enzymes圖1 Nhlh2啟動子片段缺失報告載體的構建Fig.1 Construction of Nhlh2 promoter fragment deletion vectors

2.2 豬Nhlh2基因啟動子不同缺失片段活性分析

將構建的8個啟動子缺失片段的報告基因重組質粒瞬時轉染至豬卵巢顆粒細胞，24 h后裂解細胞并收集裂解液進行雙熒光素酶活性檢測。結果顯示，P1～P6片段雙熒光素酶活性差異不顯著；P7(-238～+129)區域的相對活性最高，說明豬Nhlh2基因的核心啟動子區域為-238～+129；與P6(-654～+129)相比，P7片段活性顯著升高了1.24倍(P=0.001 8)，表明-654～-238片段范圍可能存在負調控元件(圖2)；與P8(-20～+129)片段相比，P7片段熒光活性下降了9.57倍(P=0.000 1)，表明-238～-20區域可能存在正調控元件(圖2)。

**. P<0.01, the same as below圖2 Nhlh2的5′端缺失片段啟動子活性Fig.2 Luciferase activities of Nhlh2 promoter 5′ deletion fragments

2.3 轉錄因子YY1、C/EBPβ與Nhlh2基因啟動子的互作

結合TFBIND、JASPAR等生物信息學軟件對-238～-20區域進行預測，發現該區域存在多個潛在的轉錄因子結合位點，本研究關注YY1和C/EBPβ與Nhlh2之間的表達調控關系。ChIP試驗結果表明，轉錄因子YY1識別并結合在Nhlh2基因-101～-85區域(圖3A)；轉錄因子C/EBPβ識別并結合在Nhlh2基因-153～-140區域(圖3B)。

A. YY1結合位點ChIP驗證結果；B. C/EBPβ結合位點ChIP驗證結果。M. DNA相對分子質量標準；Anti-YY1/Anti-C/EBPβ. 試驗組；input/Anti-RNA polymerase II. 陽性對照；IgG. 陰性對照A. ChIP validation of YY1 binding site at Nhlh2; B. ChIP validation of C/EBPβ binding site at Nhlh2. M. DNA marker DL500; Anti-YY1/Anti-C/EBPβ. Experimental group; Input/Anti-RNA polymerase II. Positive control; IgG. Negative control圖3 Nhlh2基因啟動子區轉錄因子結合位點ChIP驗證Fig.3 The results of transcription factor binding sites at Nhlh2 gene promoter by ChIP

2.4 豬Nhlh2基因核心啟動子區轉錄因子結合位點的活性驗證

如圖4和圖5所示，以pGL3-P7為野生型，構建兩個轉錄因子結合位點的突變體pGL3-P7-YY1-Mut、pGL3-P7-C/EBPβ-Mut，并構建了pCDNA3.1-YY1和pCDNA3.1-C/EBPβ兩個真核表達載體及干擾小RNA(YY1-siRNA和C/EBPβ-siRNA)轉染至豬卵巢顆粒細胞，探索YY1和C/EBPβ與Nhlh2之間的表達調控關系。

結果顯示，pGL3-P7-YY1-Mut與野生型相比，雙熒光素酶活性上調0.42倍(P=7.22×10-11)(圖4A)；超表達YY1后，pGL3-P7的雙熒光素酶活性下調了0.36倍(P=1.28×10-2)(圖4B)；抑制YY1的表達后，pGL3-P7的雙熒光素酶活性上調了0.85倍(P=2.79×10-4)(圖4C)。pGL3-P7-C/EBPβ-Mut與其野生型相比，雙熒光素酶活性上調1.53倍(P=2.23×10-13)(圖5A)；超表達C/EBPβ后，pGL3-P7的雙熒光素酶活性下調了3.49倍(P=2.03×10-4)(圖5B)；抑制C/EBPβ的表達后，pGL3-P7的雙熒光素酶活性上調了0.52倍(P=1.35×10-2)(圖5C)。

A. YY1 結合位點突變對Nhlh2啟動子活性影響；B. 超表達YY1對Nhlh2啟動子活性影響；C. YY1-siRNA對Nhlh2啟動子活性影響A. Effects of YY1 binding site mutation on the promoter activity of Nhlh2; B. Effects of overexpressed YY1 on the promoter activity of Nhlh2; C. Effects of YY1-siRNA on the promoter activity of Nhlh2圖4 YY1對豬Nhlh2啟動子活性的影響Fig.4 Effects of YY1 on the promoter activity of porcine Nhlh2 gene

A. C/EBPβ結合位點突變對Nhlh2啟動子活性影響；B. 超表達C/EBPβ對Nhlh2啟動子活性影響；C. C/EBPβ-siRNA對Nhlh2啟動子活性影響A. Effects of C/EBPβ binding site mutation on the promoter activity of Nhlh2; B. Effects of overexpressed C/EBPβ on the promoter activity of Nhlh2; C. Effects of C/EBPβ-siRNA on the promoter activity of Nhlh2圖5 C/EBPβ對豬Nhlh2啟動子活性的影響Fig.5 Effects of C/EBPβ on the promoter activity of porcine Nhlh2 gene

3 討 論

大量研究表明，哺乳動物的Nhlh2參與調控卵泡的成熟、排卵及初情期啟動等繁殖活動[4, 6]，Nhlh2可能是影響母豬繁殖活動的重要候選基因。本研究以長大二元雜交母豬卵巢的基因組DNA為模板，成功構建了8個Nhlh2基因不同缺失長度的啟動子雙熒光素酶報告載體，雙熒光活性檢測結果表明，P7的啟動子活性最高，說明Nhlh2基因的核心啟動子區域為-238～+129(圖2)。同時，P7的啟動子活性是P6的2.24倍、P8的10.57倍，表明-654～-238片段范圍可能存在負調控元件，而-238～-20區域可能存在正調控元件(圖2)。另外，P8的啟動子活性與pGL3-basic空載體相近，因此P8可能無啟動子活性。

生物信息學分析表明，Nhlh2啟動子區-101～-85和-153～-140區域分別是轉錄因子YY1、C/EBPβ的潛在結合位點。本試驗利用ChIP技術驗證了轉錄因子YY1和C/EBPβ結合在Nhlh2基因核心啟動子區域(圖3)。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，pGL3-P7-YY1-Mut與野生型相比，雙熒光素酶活性顯著上調；超表達YY1后，pGL3-P7-YY1的雙熒光素酶活性顯著下調，抑制YY1的表達后，pGL3-P7-YY1的雙熒光素酶活性顯著上調。同時，pGL3-P7-C/EBPβ-Mut與野生型相比，雙熒光素酶活性顯著上調，超表達C/EBPβ后，pGL3-P7-C/EBPβ的雙熒光素酶活性顯著下調，抑制C/EBPβ的表達后，pGL3-P7-C/EBPβ的雙熒光素酶活性顯著上調，這些結果表明，轉錄因子YY1、C/EBPβ結合在Nhlh2基因啟動子上抑制其轉錄活性。

研究表明，轉錄因子YY1通過結合在Kiss1基因的啟動子上，參與并調控下丘腦GnRH的分泌，進而影響雌性動物初情期啟動[14-15]。YY1突變雌性個體表現出發情啟動失敗、無性行為、不育[16]，并且在卵母細胞和顆粒細胞之間的信號傳導中扮演重要角色，參與調控卵泡顆粒細胞的生長發育與卵母細胞成熟[17-18]。更重要的是，在哺乳動物初情期啟動過程中，YY1結合在大量表達上調基因的啟動子上[19]。轉錄因子C/EBPβ是一類結合于DNA增強子區域的多功能反式作用因子，其也和卵巢卵泡的發育密切相關[20-21]。研究表明，特異性敲除卵巢顆粒細胞C/EBPβ后，卵泡發育停滯，無法發生排卵和形成黃體[22]。同時，研究發現，C/EBPβ調控卵巢雌激素和孕酮的合成[23-24]，如果抑制卵巢C/EBPβ的表達，將引起小鼠的排卵異常[25]，導致小鼠無生育能力[26]。C/EBPβ也可以調節瘦素受體基因的表達，進而調節小鼠排卵[27]。這些研究結果表明，YY1和C/EBPβ參與調控哺乳動物卵泡的成熟、排卵及初情期啟動等繁殖活動，也佐證了Nhlh2可能是影響母豬繁殖活動的重要候選基因。

4 結 論

本研究通過構建豬Nhlh2啟動子缺失片段報告基因系統，發現Nhlh2基因的核心啟動子區域為-238～+129，-654～-238片段范圍可能存在負調控元件，而-238～-20區域可能存在正調控元件；轉錄因子YY1、C/EBPβ結合在Nhlh2基因啟動子上抑制其轉錄活性。本研究為后續母豬Nhlh2基因的結構和功能研究提供了分子基礎。

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