miR-142和miR-144靶向FoxO1基因調節綿羊前體脂肪細胞分化的研究

趙艷艷，喬利英，景炅婕，潘洋洋，任端陽，王書芳，呂宣增，劉文忠

(山西農業大學動物科技學院，太谷 030801)

動物脂肪組織在體內發揮著重要功能，不僅通過提供能量、維持體溫、保護內臟等維持內環境穩態[1]，其含量的多少還影響家畜的生產性能，特別是肉品質。脂肪組織的發育和沉積取決于前體脂肪細胞的分化與生長。哺乳動物叉頭狀蛋白O(Forkhead box O, FoxO)是一個轉錄因子家族，廣泛參與細胞進程，如DNA修復、細胞周期調控、抗逆性、凋亡及代謝等[2]。其中，FoxO1由FoxO1基因編碼，其活性受磷酸化和去磷酸化過程的調節[3]，P13K/Akt和MAPK/ERK通路使FoxO1磷酸化[4]，從而導致FoxO1蛋白的轉錄活性受到抑制[5]。

miRNA對機體的正常運轉發揮極為重要的調節作用，不但參與細胞分化、發育、增殖、凋亡等過程，還對器官的正常發育和腫瘤的形成起著重要作用[6]。miRNA主要是與靶基因mRNA結合，在轉錄后水平調節基因的表達。研究顯示，脂肪細胞分化與miRNA有重要的關系[7]。例如，miR-130可下調PPARγ的表達，從而抑制脂肪形成[8]。

miRNA可直接調節靶基因的表達，也可通過調節轉錄因子的活性間接影響基因表達。關于miRNA靶向調節FoxO1的機制在人類疾病研究方面報道較多。miR-96通過作用于FoxO1促進人卵巢黃素化顆粒細胞的存活和增加孕激素分泌量[9]。在人工培養的一種非小細胞肝癌(Non-small cell lung cancer)細胞系A549中發現，miR-183通過抑制FoxO1基因表達，促進A549細胞生長[10]。miR-153可下調FoxO1和PTEN的表達促進正常前列腺細胞增殖，進而抑制癌細胞增殖[11]。miR-374可下調FoxO1的表達促進人骨肉瘤細胞的增殖[12]。這些例子說明FoxO1可以通過調節不同的靶基因發揮不同的生物學功能。FoxO1的一個重要靶基因是PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ)。二者結合可抑制脂肪細胞的分化，而PPARγ本身則是促進脂肪細胞分化的，說明FoxO1下調PPARγ的表達。FoxO1在脂肪細胞分化晚期呈高表達趨勢[13]，應該是FoxO1下調PPARγ的表達而導致的。磷酸化的FoxO1在細胞質中，當其去磷酸化后進入細胞核中靶向作用于PPARγ，使其活性降低[14]。然而，脂肪細胞分化中，FoxO1的miRNA調節機制尚不清楚。

本研究擬首先利用生物信息學方法，預測與FoxO1基因具有靶標關系的miRNAs。然后在體外培養的綿羊前體脂肪細胞中驗證FoxO1基因與相關miRNA的靶標關系。由此，揭示FoxO1基因在脂肪細胞分化中的miRNA調節作用，為闡明脂肪細胞分化的網絡調控機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 本研究所用試驗動物為1只出生1周內的小尾寒羊羔羊。將其屠宰后，迅速采集其皮下脂肪組織。一部分用酒精消毒后放入無菌PBS中帶回實驗室，用于細胞培養；另一部分裝入無RNase的離心管中，置-80 ℃冰箱保存，用于總RNA的提取。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶XhoⅠ和SalⅠ、DNA膠純化試劑盒、T4連接酶、RNAiso Plus、SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒和PrimeScript?RT reagent kit反轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司；氯仿和異丙醇購自天津市風船化學試劑科技有限公司；75%的酒精購自新泰市潤生醫療衛生用品科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)粉末、Tween-20和青鏈霉素購自索萊寶生物科技有限公司；DMEM/F-12 (HAM)、DMEM/lowGlucose和DMEM/HighGlucose 3種培養基以及胎牛血清購自Biological Industries；Trans5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒購自Promega公司；發光液購自北京康為世紀生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；II 型膠原酶和胰蛋白酶購自Sigma公司；總蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物公司；FoxO1A和羊抗兔IgG-HRP購自華安生物技術有限公司；Rabbit anti-GAPDH (AB-P-R 001) 購自杭州賢至生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 與FoxO1具有靶標關系的miRNA生物信息學預測 利用TargetScan[15]、PITA[16]、StarBase[17]、miRanda[18]4個在線軟件，預測與FoxO1基因具有靶標關系的miRNAs。用Venny2.1[19]在線軟件對4個靶基因預測軟件得出的結果做韋恩圖取交集，以聚焦調節FoxO1的miRNAs。各個軟件的功能及其網址見表1。

1.2.2 引物設計與合成 根據NCBI核酸數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中公布的綿羊FoxO1基因的預測mRNA序列(登 錄號：XM_012106873)，利用NCBI中Primer BLAST設計綿羊FoxO1-CDS熒光定量PCR引物和FoxO1-3′UTR PCR引物。用18S rRNA基因和β-actin基因為內參基因。miRNA采用莖環法設計引物，以U6為內參基因。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司和賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。引物序列見表2。

表1生物信息學在線軟件

Table1Onlinebioinformaticssoftwaresusedinthisstudy

軟件Software功能Function網址WebsiteTargetScan預測miRNA靶基因http://www.targetscan.org/vert_71/PITA預測miRNA靶基因https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_prediction.htmlStarBase預測miRNA靶基因http://starbase.sysu.edu.cn/miRanda預測miRNA靶基因http://www.microrna.org/microrna/getMrna.do?gene=56458&utr=20147&organism=10090#hdVenny2.1制作韋恩圖http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html

表2實時熒光定量PCR和載體構建所用引物序列及內參引物序列

Table2PrimersequencesforqPCR,plasmidconstructionandreferencegenes

引物名稱Primername引物序列(5'-3')PrimersequenceFoxO1-3'UTRF:CCGCTCGAGCGGCTTGGCAGCGAGGACACTTTR:ACGCGTCGACGTCGTGAATTATGGGGTGCCGTGAFoxO1-CDSF:GTGACTTGGACGGCATGTTTR:GTCTCCATCCATGAGGTCGTTβ-actinF:CAGCCTTCCTTCTTGGGTATR:TGGCATAGAGGTCTTTACGG18SrRNAF:CAGACAAATCACTCCACCAAR:GAAGGGCACCACCAGGAGTmiR-142F:ACACTCCAGCTGGGTGTAGTGTTTCCTACTTR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCATAAAmiR-144F:ACACTCCAGCTGGGTACAGTATAGATGATGR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTAGTACAU6F:CTCGCTTCGGCAGCACAR:AACGCTTCACGAATTTGCGT統一引物UnifiedreverseprimerTGGTGTCGTGGAGTCG

F. 上游引物；R. 下游引物。標下劃線的序列為XhoⅠ、SalⅠ酶切位點，加粗的序列為保護堿基

F. Forward primer; R. Reverse primer. The underlined sequences areXhoⅠ andSalⅠ digestion sites, bold sequences are protection bases

1.2.3 總RNA的提取與反轉錄 按照RNAiso Plus說明書的步驟，提取綿羊脂肪組織的總RNA，測定總RNA的量和濃度，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照PrimeScript?RT reagent kit 反轉錄試劑盒步驟進行反轉錄。反轉錄產物(cDNA)-20 ℃下保存備用。

1.2.4FoxO1-3′UTR 載體構建 根據預測的靶向FoxO1基因的miRNAs，設計包含miR-142、miR-144和FoxO1結合區域的FoxO1 mRNA 3′UTR 序列擴增引物FoxO1-3′UTR。在引物中加入XhoI和SalI兩種限制性內切酶的酶切位點及各自的保護堿基(表2中分別標下劃線和加粗的序列)。以cDNA為模板，對FoxO1-3′UTR進行擴增。將得到的產物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，將目的條帶進行膠回收和純化。利用XhoI、SalI內切酶對FoxO1-3′UTR的PCR產物和pmir-GLO載體分別進行雙酶切。膠回收FoxO1-3′UTR和pmir-GLO載體酶切產物，然后進行連接、轉化、菌落的培養和菌液的測序，測序鑒定成功的重組質粒命名為pmir-FoxO1。

1.2.5 前體脂肪細胞培養 將采集的綿羊皮下脂肪組織用PBS反復洗3遍，之后用剪刀剪碎，加入Ⅱ型膠原酶，在37 ℃搖床中200 r·min-1搖晃消化30 min左右。將脂肪組織消化成黏稠狀后加入等體積的完全培養基終止消化，700×g 離心10 min。棄上清液，將底部的沉淀用完全培養基重懸，再次離心以洗凈組織。分別用200和400目網篩過濾，留下濾液。加入適量的完全培養基，在37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。完全培養基為普通培養基DMEM/F-12(HAM)中加入1%雙抗和10%胎牛血清(FBS)。

1.2.6 細胞單轉染與共轉染 單轉染中，將綿羊前體脂肪細胞培養于6孔板中，待細胞密度達到80%左右時，按照Lipofectamine 2000說明書對細胞進行轉染。試驗分為3組，轉染miR-142 mimic(或miR-144 mimic)為過表達組，轉染miR-142 NC(或miR-144 NC)為陰性對照組，不做任何轉染為空白對照組(Blank)。每組設置3個重復。轉染后24 h收集細胞，提取總RNA。利用qPCR檢測過表達后miR-142、miR-144和FoxO1基因mRNA的表達量。利用Western blotting檢測過表達后FoxO1蛋白的表達量。

共轉染中，將HEK293T細胞培養于24孔板中，待細胞密度達到80%左右時，按照Lipofectamine 2000說明書對細胞進行轉染。試驗分為2組，共轉染pmir-FoxO1與miR-142 mimic(或miR-144 mimic)為過表達組，共轉染miR-142 NC(或miR-144 NC)和pmir-FoxO1為陰性對照組。轉染48 h后，利用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒進行雙熒光素酶檢測。

1.2.7 FoxO1 RNA和蛋白表達量檢測 按照RNAiso Plus說明書的步驟，從培養的綿羊前體脂肪細胞中提取總RNA，測定RNA的量和濃度，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。根據PrimeScript?RT reagent kit反轉錄試劑盒說明書對提取的RNA進行反轉錄獲得cDNA。將反轉錄后的cDNA稀釋到50 ng·μL-1，作為熒光定量PCR的模板，用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進行實時熒光定量PCR，分別測定miR-142、miR-144和FoxO1 mRNA的表達量。

對于兩個miRNAs，反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTM (2×) 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，miRNAs Specific primer (10 μmol·L-1) 0.8 μL，統一反向引物(10 μmol·L-1)0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL，總體積為20 μL。將以上反應體系放入7500熒光定量PCR儀器(ABI 公司)中，按照以下程序運行：(1)預變性：95 ℃ 30 s；(2)PCR反應階段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s(此步驟共進行45個循環)；(3)熔解曲線分析階段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

對于FoxO1 mRNA，反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTM (2×) 10 μL，ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL，FoxO1上游引物(10 μmol·L-1) 0.8 μL，FoxO1下游引物 (10 μmol·L-1) 0.8 μL，cDNA產物2 μL，ddH2O 6 μL，總體積為20 μL。反應程序：預變性：95 ℃ 30 s。PCR反應階段：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共45個循環。熔解曲線分析階段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

利用Western blotting檢測FoxO1蛋白的表達量：收集轉染48 h后的綿羊前體脂肪細胞，用全蛋白提取試劑盒按照說明書提取全蛋白。以每孔40 μg上樣量進行SDS-PAGE。將目的蛋白從凝膠轉移至NC膜上，隨后用5%的脫脂奶粉封閉，以1∶1 000比例，孵育一抗(FoxO1A或Rabbit anti-GAPDH (AB-P-R 001))，以1∶4 000比例，孵育二抗(羊抗兔IgG-HRP)，用PBST緩沖液(PBST緩沖液是PBS與Tween-20以500∶1比例配置)洗膜后涂布適量發光液，最后拍照觀察。最后用Image Lab蛋白灰度值分析軟件處理免疫印跡條帶圖，并進行定量分析。

1.2.8 前體脂肪細胞分化檢測 為了直觀說明miR-142和miR-144對綿羊前體脂肪細胞分化的影響，設置4組試驗，每組3個重復，待細胞密度達到80%左右時，按照Lipofectamine 2000說明書分別轉染miR-142 mimic、miR-142 NC、miR-144 mimic和miR-144 NC。但轉染miR-142和miR-144的綿羊前體脂肪細胞來自不同批次。將轉染后第2天的細胞用誘導分化培養基(DMEM/low Glucose培養基中加10%的胎牛血清、10 μmol·L-1胰島素、1 μmol·L-1地塞米松、0.5 mmol·L-13-異丁基-1-甲基黃嘌呤和2 mmol·L-1羅格列酮)培養，分化8 d后進行油紅O染色，顯微鏡下拍照觀察。

1.2.9 數據分析 雙熒光素酶檢測結果用螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，即熒光值表示。用t-檢驗分析熒光值的組間差異。用2-ΔΔCt法計算FoxO1 mRNA和miR-142(或miR-144)的相對表達量。用目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值計算FoxO1蛋白的相對表達量。對于miR-142、miR-144和FoxO1基因的mRNA和蛋白表達量，配合一般線性模型，以組為因子用SPSS 17.0 (SPSS Inc, Chicago, Ⅲ, USA)進行方差分析。各表達量的柱形圖用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA)繪制。

2 結 果

2.1 預測的與FoxO1具有靶標關系的miRNAs

用TargetScan、PITA、StarBase和miRanda在線軟件，預測出與FoxO1具有靶標關系的miRNAs分別有15、70、48和42個。用Venny2.1.0取交集，結果如圖1所示?？梢姡?個軟件共同預測出6個miRNAs，分別為miR-183、miR-96、miR-144、miR-153、miR-374、miR-142。經PubMed數據庫檢索，發現miR-96、miR-183、miR-153 和miR-374這4個miRNAs與FoxO1的靶標關系已得到驗證。于是，本研究以miR-142和miR-144為研究對象。miR-142種子區序列(2～7)堿基與FoxO1-3′UTR第2 524～2 529個堿基完全互補。miR-144種子區序列(2～8)堿基與FoxO1-3′UTR第2 679～2 685個堿基完全互補。在TargetScan中，miR-142的綜合排序高于miR-144。這些結果一方面在理論上說明miR-142和miR-144與FoxO1具有靶標關系，另一方面也說明，二者在FoxO1-3′UTR上的結合位點很近。

圖1 預測的與FoxO1基因具有靶標關系的miRNAsFig.1 Predicted miRNAs potentially targeting to FoxO1 gene

2.2 驗證的與FoxO1具有靶標關系的miRNAs

共轉染pmir-FoxO1和miR-142 mimic后，過表達組的熒光活性(6.76±0.31)極顯著(P<0.01)地低于陰性對照組(14.61±1.09)。與之相似，共轉染pmir-FoxO1和miR-144 mimic后，過表達組的熒光活性(9.78±0.46)也顯著(P<0.05)低于陰性對照組(15.58±1.23)。說明miR-142和miR-144與FoxO1-3′UTR靶位點的結合抑制了熒光信號的產生。比較而言，miR-142的抑制作用更強一些，這與理論預測得到的miR-142較miR-144的分值高是一致的。

2.3 過表達miR-142對FoxO1 mRNA表達的影響

轉染miR-142 mimic的過表達組中，miR-142的表達量(22.97±1.587)極顯著(P<0.01)高于陰性對照組(0.64±0.31)和空白對照組(0.43±0.03)(圖2A)。由此說明，miR-142 mimic成功轉入了綿羊前體脂肪細胞中。相應地，過表達組中FoxO1 的表達量(0.51±0.03)極顯著(P<0.01)低于陰性對照組(1.36±0.08)和空白對照組(1.12±0.07)(圖2B)?？梢?，miR-142的過表達導致FoxO1顯著低表達，即miR-142負調節FoxO1基因的表達。

2.4 過表達miR-144對FoxO1 mRNA表達的影響

轉染miR-144 mimic的過表達組中，miR-144的表達量(506.04±20.00)極顯著(P<0.01)高于陰性對照組(0.78±0.11)和空白對照組(0.38±0.06)(圖3A)。說明miR-144 mimic成功轉入了綿羊前體脂肪細胞。而過表達組中FoxO1 的表達量(0.88±0.05)則極顯著(P<0.01)低于陰性(2.55±0.09)和空白對照組(2.91±0.17)(圖3B)。同樣說明，miR-144的過表達導致FoxO1 顯著低表達，即miR-144負調節FoxO1的基因表達。

2.5 過表達miR-142和miR-144對FoxO1蛋白表達的影響

過表達miR-142和miR-144后，FoxO1蛋白的表達情況見圖4。圖中顯示了Western blotting條帶(圖4A1、4A2)和根據灰度值計算出的蛋白表達量(圖4B1、4B2)。過表達組中FoxO1的表達量均顯著(P<0.05)低于相應的陰性和空白對照組。由此說明，miR-142和miR-144與FoxO1靶位點結合后，均抑制了FoxO1蛋白的表達。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，圖3同The different uppercase letters mean significant difference (P<0.01), the same as Figure3圖2 過表達miR-142后miR-142和FoxO1 mRNA在綿羊前體脂肪細胞中的表達Fig.2 The expression of miR-142 and FoxO1 mRNA in ovine preadipocytes after over-expressing miR-142

圖3 過表達miR-144后miR-144和FoxO1 mRNA在綿羊前體脂肪細胞中的表達Fig.3 The expression of miR-144 and FoxO1 mRNA in ovine preadipocytes after over-expressing miR-144

A1、A2.過表達miR-142和miR-144后FoxO1的Western blotting條帶圖；B1、B2.過表達miR-142和miR-144后FoxO1蛋白表達量。不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)A1, A2. Western blotting diagram of FoxO1 after over-expressing miR-142 and miR-144, respectively; B1, B2.FoxO1 protein expression level after over-expressing miR-142 and miR-144, respectively. The different lower case letters mean significant difference between groups (P<0.05)圖4 過表達miR-142和miR-144后FoxO1蛋白在綿羊前體脂肪細胞中的表達Fig.4 The expression of FoxO1 protein in ovine preadipocytes after over-expressing miR-142 and miR-144

2.6 過表達miR-142和miR-144對脂肪細胞分化的影響

在細胞培養的第8天，對培養中的細胞進行油紅O染色，發現過表達miR-142和miR-144的兩個組的脂滴數分別高于相應的陰性對照組(圖5)。說明，過表達miR-142和miR-144均可促進綿羊前體脂肪細胞分化，加快脂滴形成。但因過表達miR-142和miR-144的細胞來自不同批次，二者的過表達組間和陰性對照組間的結果不可比。

著色區域是被油紅O染色后的脂肪細胞The stained areas are the adipocytes stained by Oil red O圖5 過表達miR-142和miR-144后綿羊脂肪細胞分化第8天的油紅O染色結果(100×)Fig.5 Oil red O staining results of differentiated ovine adipocytes at 8th day by over-expressing miR-142 and miR-144(100×)

3 討 論

基因和miRNA間的靶標關系通?？梢栽谏镄畔W預測的基礎上再通過分子生物技術驗證確定，這樣可以大大提高研究的準確性。本研究先利用4個在線軟件對FoxO1基因進行候選miRNAs預測。其中，TargetScan軟件最大的特點是強調miRNA的物種間保守性[15]，因而預測出的miRNAs最少。本研究的對象是綿羊，在miRBase 21中記錄的綿羊miRNA序列只有153個(OARv3.1)，遠少于常規反芻家畜，更少于人和小鼠。因此，物種保守性對于本研究尤為重要。PITA采用的是自由參數模型計算miRNA-mRNA二聚體的自由能和解除靶標關系所消耗能量差[16]，預測范圍較大，預測出的miRNAs最多。miRanda和StarBase也有其相應的特性和算法。為此，又結合Venn圖，預測得到6個候選miRNAs。在此基礎上，結合前人研究結果，確定miR-142和miR-144用于本研究中的后續試驗驗證。

在人、鼠、豬和牛的研究中發現，FoxO1與能量代謝密不可分。FoxO1通過增加β細胞數量，增強β細胞葡萄糖傳感和抗氧化功能，改善了β細胞的補償，從而調節營養過?；蚍逝諿20]。肥胖狀態下，胰島素通過調節FoxO1的磷酸化可改善葡萄糖代謝[21]。FoxO1參與脂肪代謝的調節。α-硫辛酸可以使FoxO1去磷酸化，減少肝中脂肪的積累[22]。減少豬FoxO1基因表達后，甘油-3-磷酸脫氫酶、甘油三酯、脂肪酸結合蛋白、PPARγ顯著增加，因而認為FoxO1是前體脂肪細胞分化過程中的負轉錄調控因子[23]。在牛的脂肪組織中PPARγ表達升高時，FoxO1的含量卻降低了[24]，這說明FoxO1與PPARγ的關系十分密切。PPARγ在脂肪代謝中的重要性已得到廣泛研究，其功能主要是促進脂肪細胞分化[25-26]，因而被認為是一個重要的監控脂肪細胞分化的基因[27]。轉錄因子FoxO1通過P13K/Akt和MAPK/ERK通路去磷酸化后[5]，進入細胞核內與PPARγ的啟動子區結合，可抑制PPARγ的活性和脂肪細胞分化，從而調節脂肪代謝[14,28]。

本研究利用體外培養的綿羊前體脂肪細胞進行研究，發現過表達miRNA-142和miRNA-144后，FoxO1 的mRNA和蛋白表達量均顯著下降，且脂滴明顯增多，說明miR-142和miR-144均可下調轉錄因子FoxO1的表達，促進脂肪細胞分化。相似的研究發現，miR-15a/b也可通過抑制FoxO1的表達，促進豬的前體脂肪細胞分化[29]。PPARγ的表達也受miRNAs的調節。miR-130[8]與PPARγ的3′ UTR 和CDS區結合，miR-301a[30]與PPARγ的3′ UTR區結合，可下調PPARγ的表達，從而抑制脂肪細胞分化。由此，作為轉錄因子的FoxO1與其靶基因PPARγ及其與二者的調節miRNAs間的關系可以概括如圖6所示。

⊕表示正調節；?表示負調節⊕means positive regulation;?means negative regulation圖6 FoxO1作用于PPARγ調節脂肪細胞分化的代謝通路Fig.6 The metabolic pathways regulating adipocyte differentiation by FoxO1 acting on PPARγ

活體試驗研究也表明，miR-142和miR-144均可調節脂肪代謝。和牛(高肌內脂肪)背脂中miR-142-3p的表達量顯著高于荷斯坦牛(中度肌內脂肪)[31]。高腹脂型北京油雞中miR-144-3p表達量極顯著高于低腹脂型北京油雞[32]。這說明miR-142-3p和miR-144-3p影響了脂肪沉積，但這些文獻并未交待其機制。用圖6的通路則可直觀地解釋其分子機制。

4 結 論

本研究通過理論預測發現，FoxO1與miR-142和miR-144存在靶標關系。用雙熒光素酶報告系統發現miR-142和miR-144抑制FoxO1的表達。過表達這兩個miRNAs后，FoxO1 mRNA及其編碼蛋白的表達量顯著下降，證實了這兩個miRNAs與FoxO1具有靶標關系，且負調節FoxO1的表達，進而通過FoxO1對PPARγ的負調節促進綿羊前體脂肪細胞的分化。

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