豬季節性高低溫的分子適應性研究

章 杰，何 航，劉安芳，羅宗剛，陳 磊

(1. 西南大學動物科學學院，榮昌 402460； 2. 重慶市畜牧科學院，榮昌 402460)

中國是世界最大的豬肉生產和消費國，豬肉產量占世界50%以上。目前，為了降低對環境的污染，在控制養殖規模的前提下，又要不影響市場供給量，就需提高豬的生產水平和健康狀況。飼養動物對環境的適應性是一個十分重要的問題，沒有良好的適應性，生產性能再好的遺傳潛力也不能充分表現，甚至不能生存[1-2]。隨著養豬業規模化、集約化程度的不斷提高，環境溫度被認為是影響豬健康和生產力的最重要的外界環境影響因素，豬可通過物理和化學調節來適應外界溫度的變化[3]。據報道，中國從加拿大、美國、英國和日本等國引進的豬種在夏季或冬季死亡率較高，并且高溫或低溫環境會導致母豬生殖失敗，如分娩率低和發情期延遲等[4]，主要原因是外來豬種對中國不同地區環境的適應性差，進而影響到中國以外來豬種為主的養豬業生產水平。而中國地方豬種由于世世代代長期生活在當地的自然條件下，形成了對當地環境的良好適應性，在極端氣候條件下也能表現出良好的生長發育和生產性能。適應性是機體抗逆性和抗病性的表現，是有一定的遺傳基礎，受到各類基因的調控。因此，了解中國地方豬種高、低溫環境下基因表達情況對理解豬的環境適應性具有一定的實踐意義，可為生產上選擇性提高豬的環境適應性奠定理論基礎，也為中國地方豬種資源的保護及開發提供理論依據。

動物馴化是人類歷史上最重要的事件之一，使人類從狩獵和采集的生活方式過渡到更安定的生活方式。大約在一萬年前，豬被馴養[5]。從那時起，豬就開始受到自然選擇和人工選擇的綜合影響，導致外貌、生育率、生長、適口性和當地適應性等表型出現顯著地分化[6]。當前，中國是家豬遺傳資源的主要擁有國家，占全球所有品種的1/3以上(約100種)。經過長期的自然選擇和人工選育，中國地方豬種已進化出了極強的適應性來適應中國廣闊的、復雜的地理生態環境[6]。中國高低緯度和不同海拔地區的地方豬種對冷熱環境溫度具有明顯的體溫調節機制。M.Z.Li等[7]通過對藏豬和四川盆地特有家豬品種從基因組水平進行了基因選擇性清除分析，結果揭示了不同海拔環境豬適應性的分子機理，并鑒定出藏豬高海拔適應性的快速進化基因268個，家豬肌肉生長、脂肪沉積、免疫基因等受到人工強烈選擇的基因516個。H.Ai等[8]在全基因組范圍內系統地鑒別出了與不同緯度環境適應性相關的219個候選基因位點，揭示了中國南方豬和北方豬適應不同環境溫度的分子機制。關于同一地區(像重慶夏季酷熱、冬季嚴寒的極端氣候地區)豬對不同環境溫度的分子適應性研究還未見報道，因此，本研究比較分析了重慶地區低、高溫月份豬能量代謝相關的分子表達水平，以期了解豬適應不同環境溫度的分子變化情況，為闡明豬適應性進化的遺傳基礎作前期研究。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本研究選取榮昌豬為試驗對象，按月份記錄6月齡(180 d)豬的月增長體重，記錄周期為1～12月，并利用全自動溫濕度記錄儀，采集試驗場所的氣溫數據。所有豬參照NRC[9](1998)豬營養標準飼喂于西南大學畜牧實訓基地，并且對豬舍溫度不進行人為控制，比如地暖、水簾和風機等。

1.2 樣品采集

在低溫(1月)和高溫(8月)各選取12頭豬進行屠宰，宰前24 h禁食、供水，宰后立即采集大腦、心、肝、肺、腎、眼肌和腰肌放入液氮中，帶回實驗室，保存于-80 ℃待用。

1.3 總DNA和RNA提取

總DNA和RNA的提取按照說明書分別使用E.Z.N.A.?Tissue DNA Kit (Omega)和Trizol(Invitrogen)進行操作。提取出的總DNA溶解于50 μL TE緩沖液中，并于-20 ℃保存備用。RNA提取后，使用RNeasy柱(Qiagen)進行純化，-80 ℃保存備用。

1.4 mtDNA拷貝數檢測

以基因組DNA為模板，使用qRT-PCR法測定線粒體DNA拷貝數。通過分別檢測單拷貝基因GCG和線粒體基因ATP6和ND1來衡量核DNA和mtDNA的含量。單個細胞mtDNA拷貝數的計算：mtDNA特異基因拷貝數/GCG基因拷貝數。使用Primer 5.0軟件設計基因擴增的特異性引物，引物序列見表1。利用SYBR?PremixEXTaqTMII kit (TaKaRa)在CFX96TMReal-Time PCR檢測系統對基因進行定量。

表1基因定量引物序列

Table1PrimersequencesofgenesusedinqRT-PCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primersequence產物長度/bpAmpliconsize退火溫度/℃TmATP6F:TATTTGCCTCTTTCATTGCCC12359R:GGATCGAGATTGTGCGGTTATCOX1F:ACTACTGACAGACCGCAACC22060R:TCCAATGGACATTATGGCTCCYTBF:TCTTCGCCTTTCACTTTATC24060R:GGGTGTAGTTGTCTGGGTCTND1F:GCCACATCCTCAATCTCCAT9961R:GATTAGAGGGTAGGGTATTGGTAGTWINKLEF:GGAAGGAGGATGATGATAAGG21158R:GGTATGGAGAAGGTAAGAGAGCHSP70F:GCCCTGAATCCGCAGAATA15260R:TCCCCACGGTAGGAAACGGCG*F:GAATCAACACCATCGGTCAAAT19860R:CTCCACCCATAGAATGCCCAGTACTB*F:CACGCCATCCTGCGTCTGGA10063R:AGCACCGTGTTGGCGTAGAGRPL4*F:CAAGAGTAACTACAACCTTC12260R:GAACTCTACGATGAATCTTCTBP1*F:AACAGTTCAGTAGTTATGAGCCAGA15360R:AGATGTTCTCAAACGCTTCG

*.參考基因

*.Reference genes

1.5 基因表達水平檢測

參照Prime-ScriptTMRT reagent kit (TaKaRa)方法，進行反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用qRT-PCR法測定基因的相對表達水平。ACTB、RPL4和TBP1作為內參基因，特異性引物序列見表1。qRT-PCR定量檢測見1.4。基因表達水平采用2-△△Ct法進行計算。

1.6 數據分析

使用SPSS 22.0軟件對數據進行One-way ANOVA、Student’st-test和Pearson相關性分析。數據結果以“平均值±標準差”表示。*P<0.05表示差異顯著;**P<0.01表示差異極顯著；ns表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結 果

2.1 豬體重增長率與環境溫度變化的關系

如圖1所示，試驗場所1～12月的平均氣溫呈現先升高后降低的趨勢，其中1月的平均氣溫最低(6.7 ℃)，8月的平均氣溫最高(30.2 ℃)。豬體重1～12月的增長率與氣溫呈階段性相關：1～4月，隨氣溫升高而升高(r=0.96，P<0.01)；4～8月，隨氣溫升高而降低(r=-0.94，P<0.01)；8～10月，隨氣溫降低而升高(r=-0.77，P<0.01)；10～12月，隨氣溫降低而降低(r=0.97，P<0.01)，說明4和10月是豬體重增長的較佳時期，即20 ℃左右的氣溫是豬體重增長的最佳溫度范圍[10]，而溫度過高或過低均會影響豬的體重增長，其中8月的豬體重增長率最低(12.24%)，反映出豬體重增長率與氣溫的相關性。上述結果表明，極端氣溫環境對豬的生長發育存在明顯的影響，為了解豬在極端氣溫條件下的代謝特點，而能量代謝則是反映豬對溫度適應性的直接過程，故本試驗進一步研究了低溫(1月)和高溫(8月)條件下榮昌豬能量代謝相關分子的表達情況。

圖1 不同月份豬體重增長率與氣溫變化的關系Fig.1 Correlation of body weight growth rate and temperature change in different months

2.2 組織間mtDNA拷貝數隨溫度的變化

如圖2A所示，對低溫和高溫下的組織間mtDNA拷貝數進行單因素方差分析顯示，組織間mtDNA拷貝數在低溫組(P=3.14×10-10)和高溫組(P=2.19×10-13)均差異極顯著。其中，低溫組mtDNA拷貝數相對較高的是眼肌和大腦，腎和肺相對較低；高溫組mtDNA拷貝數最高和最低的分別是眼肌和肺，說明mtDNA拷貝數在低溫組和高溫組之間展現出非常高的一致性(r=0.92,P<0.01; 圖2B)。

圖2 mtDNA拷貝數的變化(A)及季節間相關性分析(B)Fig.2 Characteristic of mtDNA copy number (A) and correlation analysis between seasons (B)

2.3 mtDNA拷貝數與環境溫度的關系

如圖3A所示，除了心組織(P>0.05)，其它組織的mtDNA拷貝數在低溫組顯著高于高溫組(P<0.05)，尤其是大腦、肺和腎達到了極顯著水平(P<0.01)，說明這3種組織比其他組織對環境溫度的變化更敏感。TWINKLE基因是合成初始D-loop鏈和mtDNA完整復制所必需的，在維持mtDNA拷貝數上發揮著重要的作用[11]。因此，假設mtDNA拷貝數在高溫組的降低可能受到TWINKLE基因表達的影響。如圖3B所示，所有組織TWINKLE基因表達在高溫組均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低，這與假設一致，表明對TWINKLE基因表達的調節是mtDNA拷貝數適應環境溫度變化機制中的重要一環。

圖3 mtDNA拷貝數(A)和TWINKLE基因表達(B)在高低溫度下的變化Fig.3 Characteristic of mtDNA copy number (A) and TWINKLE gene expression (B) in high and low temperature

2.4 能量代謝相關基因表達與環境溫度的關系

如圖4所示，能量代謝相關基因(ND1、COX1、ATP6和CYTB)在組織中的表達水平基本上均是低溫組顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于高溫組，而眼肌中ND1和COX1基因，肝和心中CYTB基因在低、高溫組間無顯著差異(P>0.05)，大腦中CYTB基因在高溫組顯著高于低溫組(P<0.05)，這可能與大腦的生理學功能相關。綜上說明豬適應低溫環境可通過補償性調整特定基因轉錄水平來重塑代謝而實現。

圖4 能量代謝相關基因在不同環境溫度下表達水平Fig.4 Energy metabolism-related genes expression in different ambient temperature

2.5 熱應激基因HSP70在不同環境溫度下的表達變化

對熱應激基因HSP70的表達水平進行了測定(圖5)，除了肺組織的HSP70基因表達水平在高溫組極顯著高于低溫組(P<0.01)，其余組織的基因HSP70表達水平在兩者之間無顯著差異(P>0.05)，說明極端環境溫度對豬除了肺組織外，對其他器官無明顯影響，豬已基本上適應了環境溫度的變化，并產生了相應的分子適應性機制。

圖5 熱應激基因HSP70在不同環境溫度的表達水平Fig.5 Expression of heat stress gene HSP70 in different ambient temperature

3 討 論

豬的被毛和絕熱層較少，并且缺乏汗腺功能，代謝產生的多余熱量不能及時有效地散出，相較于其他動物對環境溫度更敏感。研究表明，環境溫度對育肥豬增重率的影響呈曲線關系[12]。在一定溫度范圍內，育肥豬的生長性能最佳，其產熱與散熱較少，僅靠物理調節就可維持體溫平衡[13-14]；低溫環境下，育肥豬為了維持體溫，不斷地消耗飼料中的能量來加快分解代謝的速度，飼料并未完全用于生長，影響其體重的增加[15]；高溫環境下，育肥豬為了減少代謝產熱，采食量大幅下降，導致其生長速度降低[16-17]。說明豬為了適應環境溫度的變化，機體也在作出相應的變化，而環境溫度的變化是季節性差異的主要因素之一，暗示了不同季節下豬的分子調控機制的差異，而本研究中的重慶地區季節性環境溫度變化極大，育肥豬的增重率也表現出明顯差異，故飼養在本地區的豬是研究環境溫度適應性的理想材料。

不同組織細胞在生命活動中行使著不同的功能，具有不同的能量需求，故線粒體含量存在差異，而mtDNA拷貝數則是反映細胞線粒體含量的直接指標[18]。本試驗中，環境溫度變化對不同組織間mtDNA拷貝數的高低排序無影響，說明機體mtDNA拷貝數整體上不會輕易受外界影響，從而保證各組織生物學功能的實現，但同一組織在不同環境溫度下mtDNA拷貝數存在差異。高溫環境下，豬為了維持體熱平衡，采食量減少，代謝產熱減弱，能量需求減少，導致mtDNA 拷貝數降低；低溫環境下，豬為了維持體溫恒定，代謝產熱增強，能量需求增加，引起mtDNA拷貝數升高。長期生活在高原和平原的同一物種mtDNA拷貝數呈現極顯著差異[19-20]，說明機體為了適應外界環境變化對其組織mtDNA拷貝數作出相應的調整。基于mtDNA拷貝數對環境變化的敏感性，可考慮將mtDNA拷貝數作為反映環境變化的分子標記。

能量代謝過程除了受mtDNA拷貝數調節外，能量代謝相關基因的表達水平同樣發揮重要作用，比如ND1、COX1、ATP6和CYTB基因。ND1基因可在呼吸鏈中直接參與電子傳遞并通過氧化磷酸化產生ATP而參與到能量代謝過程[21]。COX1基因能把氧化還原反應中的能量通過OXPHOS轉變為ATP，在細胞有氧代謝過程中起著重要作用[22]。ATP6基因參與線粒體氧化磷酸化的調控，從而合成ATP[23]。CYTB基因可通過鐵的化合價互變傳遞電子[24]。本試驗中，低溫環境下，ND1、COX1、ATP6和CYTB基因表達水平在絕大多數組織中顯著高于高溫環境，說明豬可通過調節特異基因表達和重塑能量代謝來適應環境溫度的變化[25]，高溫環境下呼吸受到抑制，代謝產熱減少，抑制能量代謝基因表達；低溫環境下能量需求較高，代謝旺盛，促進能量代謝基因表達。

動物機體在受到高溫刺激時，組織細胞會快速產生一類高度保守的保護性熱休克蛋白來抵抗對細胞的損傷[26]。研究表明，HSP70是熱休克蛋白家族中最保守，含量最豐富的一種非特異性的內源保護蛋白，具有保護細胞、減少炎癥反應、抗細胞凋亡等功能，在高熱環境刺激下，HSP70基因的表達量會顯著升高[27-29]。本研究中，除了肺，其余組織HSP70基因的表達量在不同的季節差異不顯著，可能是本研究的試驗豬長期生活在該地區，已適應其自然環境溫度的變化，說明豬具有極強的適應性。肺作為重要的呼吸系統組成部分，在高溫環境下，為了散熱控溫，其呼吸頻率升高，極易出現熱喘行為，引起肺損傷[30]，故HSP70基因表達量升高。

4 結 論

本研究通過檢測季節性高低溫環境下組織mtDNA拷貝數及能量代謝相關基因表達水平，初步探究了豬在分子水平對環境溫度的適應性變化。結果提示，豬能量代謝相關基因轉錄水平及mtDNA拷貝數隨著季節性環境溫度的變化而發生了顯著變化，但機體對環境的適應性變化是一個復雜性、系統性的過程，因此，還需進一步更為深入的研究來闡明具體的機制。

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