TGF-β調節(jié)仔豬睪丸支持細胞增殖的機制

黃 莎，孫 思，鄧 潔，胡 煜，練 雨，王鮮忠

(西南大學動物科技學院 重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 400716)

TGF-β是一種多肽類細胞因子，具有調節(jié)細胞增殖、凋亡、分化和免疫抑制等作用[1]；研究TGF-β調控支持細胞增殖的機制能為治療和預防雄性生殖障礙疾病奠定基礎。TGF-β參與了多種細胞的增殖調節(jié)，Smad信號通路在其中發(fā)揮了重要作用[2]。原癌基因c-Myc是TGF-β/Smad信號通路下游重要的靶基因，是促進細胞從G1期～S期轉換的轉錄激活因子，在調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮著重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Smad蛋白可以通過與c-Myc的直接相互作用和Skp2的募集來增強c-Myc的泛素化，下調c-Myc蛋白的表達水平，達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。在癌癥發(fā)生早期，TGF-β也可通過下調c-Myc表達達到抑癌作用[4]。C.Itman等[5]發(fā)現(xiàn)，TGF-β對支持細胞的增殖過程具有一定的調節(jié)作用；但TGF-β是否通過TGF-β/Smad通路，進一步調節(jié)c-Myc和Skp2的表達水平來調節(jié)睪丸支持細胞的增殖，目前還不清楚。miR-24是一種功能多樣的miRNA，與腫瘤形成、細胞增殖、凋亡及分化有密切的關系[6]。TGF-β能誘導SMMC-7721細胞中miR-23a～27a～24-2基因簇的表達，而且該基因簇的miRNA具有抗凋亡促增殖的作用[7-8]。但miR-24是否也參與了TGF-β誘導的支持細胞增殖還不清楚。本研究利用體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細胞，研究TGF-β是否通過影響miR-24的表達，進而影響Smads的活性并調節(jié)c-Myc和Skp2的表達，從而調控細胞增殖，為進一步揭示TGF-β調控支持細胞增殖的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

DMEM/F-12Hams、胎牛血清和新生小牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、Ⅵ型膠原酶購自美國Sigma公司；TGF-β1購自美國PeproTech公司；p-Smad3(Ser423)、Smad3和beta-Actin抗體購自北京博奧森生物技術有限公司?？俁NA提取試劑盒、反轉錄及熒光定量試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。仔豬睪丸采自重慶本地3周齡長白豬。

1.2 細胞培養(yǎng)

睪丸支持細胞分離培養(yǎng)按照實驗室前期所建立的方法進行[9]。利用GATA-4作為標記分子通過免疫熒光進行支持細胞純度鑒定，如果純度高于90%，則可以用于后續(xù)試驗。

1.3 TGF-β對支持細胞增殖的影響

細胞培養(yǎng)至48 h左右，用不同濃度的TGF-β (0～300 pg·mL-1)處理細胞不同時間(0～48 h)，用CCK-8試劑盒檢測支持細胞活性；通過流式細胞術檢測TGF-β對支持細胞周期的影響。

1.4 TGF-β對Smad3磷酸化及ssc-miRNA-24表達的影響

用TGF-β(180 pg·mL-1)處理支持細胞不同時間(0～48 h)。通過Western blotting檢測細胞中Smad3磷酸化水平；通過RT-qPCR檢測ssc-miRNA-24的表達水平。

1.5 TGF-β/Smad通路抑制劑LY2109761對TGF-β作用的影響

加入1、10、100 μmol·L-1TGF-β/Smad通路抑制劑LY2109761處理細胞6 h，然后用TGF-β處理細胞24 h，用CCK-8試劑盒檢測支持細胞活性，篩選出最佳作用濃度。

用上述試驗得到的最適濃度抑制劑LY2109761(10 μmol·L-1)預處理細胞6 h，然后加入TGF-β處理支持細胞24 h。通過流式細胞術檢測細胞周期；用RT-qPCR檢測c-Myc、Skp2 mRNA表達水平。

1.6 ssc-miRNA-24模擬物、抑制劑對TGF-β調節(jié)支持細胞增殖的影響

ssc-miRNA-24模擬物(Mimics)、抑制劑(Inhibitor)和NC陰性對照(Negative control)序列由廣州銳博生物科技有限公司設計并合成。RNA oligo合成信息見表1。

表1RNAoligo合成

Table1ThesequencesofRNAoligo

項目Item序列Sequence模擬物(5'-3')Mimics抑制劑(5'-3')Inhibitorssc-miRNA-24TGGCTCAGTTC-AGCAGGAACAGF:UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAGR:ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUCCCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC陰性對照NegativecontrolTTCTCCGAACG-TGTCACGTTF:UUCUCCGAACGUGUCACGUTTR:ACGUGACACGUUCGGAGAATTCAGUACUUUUGUGUAGUACAA

細胞貼壁約60%～70%后，將目的基因轉染到支持細胞內，在32 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h，轉染過程具體操作步驟按照實驗室前期所建立的方法進行[10]。然后用TGF-β(180 pg·mL-1)處理支持細胞24 h，用CCK-8試劑盒檢測支持細胞活性，通過Western blotting檢測Smad3磷酸化水平，用RT-qPCR檢測c-Myc、Skp2 mRNA的表達水平。

1.7 支持細胞活性與周期檢測

用CCK-8試劑盒檢測支持細胞活性。將CCK-8加入到樣品中反應1～4 h，酶標儀測定吸光度(OD450 nm)。依據說明書上的細胞存活計算公式計算細胞活性。公式：細胞活性(Cell viability，%)=(OD加藥處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

通過流式細胞術檢測細胞周期。選擇氬離子氣體激光器為激光光源，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm，用Mod Fit LT軟件進行統(tǒng)計分析，根據結果分別計算PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%，SPF=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。其中S、G2、G1、G0、M分別表示細胞周期。

1.8 Western blotting檢測

細胞相應處理后，提取蛋白樣品，用BCA蛋白濃度測試試劑盒檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳和Western boltting按文獻[9]所述的方法進行。Rabbit Anti-phospho-Smad3(Ser423)和Rabbit Anti-Smad3按1∶300進行稀釋，Rabbit Anti-beta-Actin按1∶250進行稀釋，所用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)按1∶1 000稀釋。

1.9 實時定量PCR(RT-qPCR)

用總RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，檢測總RNA的純度和濃度[11]，調節(jié)反轉錄所用模板濃度，并用反轉錄合成試劑盒進行反轉錄合成cDNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。根據GenBank中β-actin、c-Myc、Skp2的mRNA序列設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表2。熒光定量PCR的反應體系總體積為10 μL，包括cDNA 0.5 μL，上下游引物(濃度為20 pmol·μL-1)各0.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.5 μL，2×SuperReal PreMix Plus(with SYBR GreenⅠ)5 μL，ddH2O為3 μL。反轉錄反應條件：25 ℃ 5 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min；實時定量PCR反應條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 10 s，68 ℃ 30 s，共39個循環(huán)。每個樣品設3個重復。

表2引物序列

Table2Thesequencesofprimers

基因Gene序列號碼Sequencenumber序列位置/bpSequenceposition產物長度/bpProductlength退火溫度/℃Tm序列(5'-3')Sequenceβ-ac-tinXM_003357928.11474～160013062.5F:CTAGTTACACACGCGGCTCTR:CATGAATACCCTGCACAGATCc-MycNM_001244917.161～18113768.0F:TGGGAGGAGACATGGTGAAR:GAGGCCAGCTTCTCTGACACSkp2NM_001171755.131～16113162.5F:CATCAAATGCCGACTGACACR:AACTGGCTTCCTGCCTACT

1.10 數據分析

2 結 果

2.1 TGF-β對支持細胞增殖的影響

圖1A結果表明，60～300 pg·mL-1的TGF-β處理細胞24 h均顯著增加了細胞的活性(P<0.05)；當TGF-β濃度為180 pg·mL-1時，這一作用最強，與對照組相比，細胞活性提高了20.93%(P<0.05)。圖1B可見，180 pg·mL-1TGF-β處理細胞不同時間對細胞活性影響存在差異，當處理時間為24 h時，作用最強，與對照組相比增加了37.76%(P<0.05)。與對照組相比，180 pg·mL-1TGF-β能以時間(0～24 h)依賴方式促進細胞增殖(P<0.05)，24 h時細胞作用最顯著；處理24 h時細胞增殖指數、S期細胞比例與對照組相比分別增加了30.04%、37.81%(P<0.05)(表3)。

A.不同濃度的TGF-β作用24 h對支持細胞活性的影響；B.180 pg·mL-1 TGF-β處理不同時間對支持細胞活性的影響。*. P<0.05。下同A. Effect of different dose of TGF-β on viability of Sertoli cells for 24 hours; B. Effect of 180 pg·mL-1 TGF-β on viability of Sertoli cells at different time points. *. P<0.05.The same as below圖1 TGF-β對支持細胞活性的影響Fig.1 Effect of TGF-β on viability of Sertoli cells

表3TGF-β處理不同時間對睪丸支持細胞PI和SPF的影響

Table3EffectofTGF-βonPIandSPFofSertolicellsatdifferenttimepoints

處理時間/hTreattime細胞增殖指數/%PIS期細胞比例/%SPF022.67±0.6012.06±0.59322.98±1.37*12.29±0.70*623.06±0.83*12.37±0.10*1223.75±1.08*12.87±0.60*2429.48±0.71*16.62±0.60*4823.40±0.67*12.66±0.70*

2.2 TGF-β對Smad3磷酸化水平及ssc-miRNA-24表達的影響

圖2A結果表明，TGF-β(180 pg·mL-1)處理0～24 h，Smad3磷酸化水平逐漸降低；處理24 h時Smad3磷酸化水平達到最低，與對照組相比，降低了58.19%(P<0.05)；處理48 h的磷酸化水平有所增加。圖2B表明，ssc-miRNA-24的表達在0～24 h內隨TGF-β處理時間延長而增加，24 h時達到最高，與對照組相比，ssc-miRNA-24的表達增加了53.67%(P<0.05)，48 h時與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

圖2 TGF-β對Smad3磷酸化水平(A)及ssc-miRNA-24表達的影響(B)Fig.2 Effect of TGF-β on Smad3 phosphorylation level(A) and ssc-miRNA-24 expression (B)

2.3 TGF-β/Smad通路抑制劑LY2109761對TGF-β作用的影響

圖3A結果表明，不同濃度的LY2109761(1、10、100 μmol·L-1)均顯著增強了支持細胞的活性，10 μmol·L-1時作用最強(P<0.05)。10 μmol·L-1LY2109761與TGF-β共同作用顯著增強了支持細胞的活性(P<0.05)， 其促增殖作用較10 μmol·L-1LY2109761單獨作用時顯著(P<0.05)，但與TGF-β單獨作用時的促增殖作用無顯著差異(P>0.05)。圖3B可以看出，與對照組相比，各處理組均增加了c-Myc和Skp2 mRNA的表達，其中，TGF-β與LY2109761的共同作用最顯著，c-Myc和Skp2 mRNA分別增加了123.26%、92.86%,達到顯著水平(P<0.05)。TGF-β、LY2109761單獨作用時細胞的PI與SPF與對照組相比均增加顯著(P<0.05)；TGF-β+LY2109761組細胞增殖顯著高于其他處理組，與對照組相比，PI增加了40.41%，SPF增加了44.73%(P<0.05)(表4)。

A. LY2109761對TGF-β誘導的支持細胞活性的影響；B. LY2109761對TGF-β誘導的c-Myc和Skp2 mRNA表達的影響A. Effect of LY2109761 on TGF-β-induced the viability of Sertoli cells; B.Effect of LY2109761 on TGF-β-induced the expressions of c-Myc and Skp2 mRNA圖3 LY2109761對TGF-β作用的影響Fig.3 Influence of LY2109761 on effect of TGF-β

2.4 ssc-miRNA-24模擬物和抑制劑對TGF-β調節(jié)支持細胞增殖的影響

從圖4A可以看出，與對照組相比，TGF-β+miR-24 mimics組、TGF-β組以及miR-24 mimics組細胞活性均顯著增加(P<0.05)，其中，TGF-β+miR-24 mimics組作用最明顯；miR-24 inhibitor組與對照組相比，其細胞活性則顯著降低(P<0.05)。從圖4B可見，TGF-β與miR-24 mimics共同作用于支持細胞時，Smad3的磷酸化水平最低，與空白對照組相比降低了36.19%(P<0.05)。從圖4C可知，水平；TGF-β和miR-24 mimics的共同作用與對照組相比，其c-MycmRNA、Skp2 mRNA的表達水平分別提高了159.72%、26.00%(P<0.05)。

表4TGF-β/Smad抑制劑LY2109761對TGF-β調節(jié)睪丸支持細胞周期的影響

Table4EffectofinhibitorLY2109761ofTGF-β/SmadonTGF-βregulatingSertolicellscycle

組別Group細胞增殖指數/%PIS期細胞比例/%SPFControl21.28±1.211.47±0.58TGF-β24.17±0.6*12.92±0.6*LY210976123.05±2.4*12.30±0.6*TGF-β+LY210976129.88±0.6*16.60±1.2*

與空白對照組相比，TGF-β及miR-24 mimics單獨或共同作用時均提高了c-Myc、Skp2 mRNA的表達

3 討 論

本研究結果表明，60～300 pg·mL-1TGF-β均增加了支持細胞活性；TGF-β濃度為180 pg·mL-1時效果最顯著。在小鼠成纖維細胞中，TGF-β1(250 pg·mL-1)可以促進細胞生長，大劑量(25 ng·mL-1)則抑制細胞生長[12]，這表明，TGF-β對細胞的作用表現(xiàn)為促進還是抑制，主要取決于細胞的類型、來源、分化狀態(tài)和生長條件[13]。

圖4 ssc-miRNA-24 mimics和 ssc-miRNA-24 inhibitor對細胞活性(A)、 Smad3磷酸化水平(B)和c-Myc、Skp2 mRNA表達(C)的影響Fig.4 Effects of ssc-miRNA-24 mimics and ssc-miRNA-24 inhibitor on cell viability(A)，Smad3 phosphorylation level(B) and c-Myc，Skp2 mRNA expression(C)

在0～24 h內，隨著TGF-β處理時間的增加，細胞增殖能力顯著增強，細胞內Smad3磷酸化水平不斷降低。在Smad依賴的信號通路中，TGF-β與TβRⅡ先結合進而磷酸化TβRⅠ形成活化的配體受體復合物，接著TβRⅠ磷酸化細胞內Smad2/3蛋白[14-15]。這表明，TGF-β可以降低Smad依賴途徑中TβRⅠ、TβRⅡ與Smad的結合活性，促進支持細胞增殖，這與敲除小鼠Smad3后創(chuàng)傷愈合速度顯著加快，抑制Smad3可以促進細胞增殖相一致[16-17]。

TGF-β能誘導支持細胞中c-Myc與Skp2的表達；TGF-β/Smad通路抑制劑LY2109761作用于支持細胞后，c-Myc、Skp2 mRNA的表達顯著升高，細胞增殖能力顯著增加。這與c-Myc是TGF-β/Smad通路中重要下游因子，可促進細胞分裂增殖，被抑制后，細胞增殖能力下降[18]相一致，也與過表達Skp2能夠促進細胞增殖相吻合[19]。這些結果說明，TGF-β能夠通過抑制Smad蛋白的信號傳導，從而上調c-Myc、Skp2基因，促進支持細胞增殖。

TGF-β能以時間依賴方式促進支持細胞中ssc-miRNA-24的表達；這與TGF-β刺激C2C12肌原細胞后，細胞中高表達的miR-24受到抑制導致細胞增殖下降[6]不符，但與TGF-β以劑量時間依賴的方式上調心成纖維細胞中miR-24水平，并刺激心成纖維細胞增殖[20]相一致。為了研究ssc-miRNA-24影響支持細胞增殖的機制，本研究利用ssc-miRNA-24模擬物和抑制劑驗證其作用。結果發(fā)現(xiàn)，ssc-miRNA-24 mimics抑制了Smad3的蛋白表達和磷酸化水平，而添加ssc-miRNA-24 inhibitor則促進了Smad3蛋白表達和磷酸化水平，這與miR-24可以抑制Smad的作用相吻合[21]，也與Smad4敲除小鼠中miR-24表達高于野生型小鼠相一致[22]。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-24 mimics使c-Myc和Skp2 mRNA表達水平顯著升高，細胞活性顯著增強；而添加miR-24 inhibitor 則顯著抑制了c-Myc和Skp2 mRNA的表達，細胞活性顯著降低。綜上表明，TGF-β可以促進ssc-miRNA-24的表達，miR-24則能與Smad3蛋白結合并降低Smad3的活性，進而增強c-Myc、Skp2的表達，從而促進支持細胞的增殖。

4 結 論

TGF-β(0～300 pg·mL-1)以時間劑量依賴方式調節(jié)支持細胞的增殖， 180 pg·mL-1TGF-β 24 h對細 胞增殖影響顯著。TGF-β能通過影響ssc-miRNA-24的表達調節(jié)Smad3的磷酸化水平，進而調節(jié)c-Myc與Skp2 mRNA的表達，從而調控支持細胞增殖。

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