SOX5蛋白對公雞精子發生和精子活力的作用及其定位

許 紅，孫研研，石 雷，劉一帆，白 皓，李云雷，黃子妍，葉建華，賈亞雄，王 梁，陳繼蘭*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193;2.北京市畜牧總站，北京 102200)

精子發生是一種復雜的細胞分化過程，包括雄性生殖細胞的一系列分子和形態學變化，且變化過程中也有許多蛋白的參與。一些參與精子發生的關鍵蛋白功能缺失會引起精子活力低下，甚至導致無精子癥[1-2]。其中SOX蛋白的編碼基因位于雄性動物Y染色體上，在個體發育過程中，廣泛參與動物早期胚胎發育[3]、性別決定和分化[4]及精子生成[5]等過程，具有重要的生物學功能。SOX蛋白由具有HMG-盒(High mobility group box，HMG-box)保守區域構成的蛋白所組成，在很多種動物的組織中均有表達。SOX家族是一種重要的轉錄調控因子，其保守的HMG-box能夠結合特定的DNA序列。根據HMG-box盒的同源程度可將SOX分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和J 10個不同亞族[5]。

SOX5作為SOXD亞族的重要成員[5]，廣泛存在于各種動物組織中，哺乳動物中包含長鏈(L-SOX5，6 kb)和短鏈(S-SOX5，2 kb)兩個亞型。L-SOX5在心、肝、肌肉和脂肪等組織中存在[6-7]。S-SOX5則主要存在于睪丸等含有鞭毛細胞的組織中[8]。S-SOX5在睪丸減數分裂后的生殖細胞中表達，尤其是在精細胞階段[8]。在家禽中，SOX5基因位于1號染色體上，含有19個外顯子，序列變異會引起雞冠形態變化[9]，但SOX5是否與精子活力相關，目前尚未見報道。

本研究通過RT-qPCR和Western blot技術探討SOX5在不同發育階段公雞睪丸中表達差異，并比較正常公雞與弱精子癥公雞睪丸中SOX5的差異。同時，采用免疫組織化學技術進行蛋白表達定位，旨在從分子水平探索SOX5在公雞睪丸精子發生和精子活力中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物來自中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所昌平試驗基地。選取0(出生24 h內)、5、15、40和60周齡的健康北京油雞公雞和40周齡弱精子癥公雞各5只，屠宰后迅速采集左側睪丸，取中心部位樣本(長1.0 cm×寬1.0 cm×高0.5 cm)放入甲醛固定液(10%福爾馬林溶液)保存，用于制備組織切片，其余樣本液氮速凍后， -80 ℃保存，用于后續試驗。弱精子癥公雞篩選參考富麗等[10]和Y.Y.Wang等[11]方法。本研究中正常個體精子活力為75.3%，弱精子癥個體精子活力為18.3%。

1.2 總RNA提取

利用RNA提取試劑盒(天根，北京)提取上述公雞睪丸組織總RNA。用核酸定量儀NanoDrop2000(Thermo scientific，美國)測定濃度，通過A260 nm/A280 nm值計算RNA純度。

1.3 cDNA合成和RT-qPCR

cDNA反轉錄參照Primer ScriptTMRT Master Mix(Perfect Real time)試劑盒(TaKaRa，美國)操作說明，反轉錄產物于-20 ℃保存備用。RT-qPCR以β-actin為內參基因，根據NCBI GenBank中雞SOX5基因和β-actin基因序列設計引物，如表1所示。采用7500型熒光定量PCR儀(ABI，美國)對SOX5和β-actin進行分析，RT-qPCR參照KAPA SYBR FAST Universal qPCR Kit(KAPA，美國)試劑盒說明書。每個樣品設置2個技術重復。

1.4 總蛋白提取和濃度測定

取100 mg左右睪丸組織，加入10倍體積的RIPA 裂解液(南京建成)，用高通量組織研磨器50 Hz 20 s，研磨3次。研磨后,冰上靜置15 min，不時搖晃。4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液即為總蛋白。所得樣品總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀)測定蛋白濃度，并用生理鹽水將蛋白濃度均一化為2 μg·μL-1，分裝，-80 ℃保存備用。

表1RT-qPCR所用基因的引物信息

Table1PrimerinformationofgenesusedinRT-qPCR

基因名稱Genename登錄號Accessionnumber引物序列(5'-3')Primersequence產物大小/bpProductsize退火溫度/℃TmSOX5NM_001004385.1F:TGGGCTAAAGATGAACGG18754R:GCTTGTATTTGTAGTCTGGGTβ-actinNM_001199586.1F:GAGAAATTGTGCGTGACATCA15258R:CCTGAACCTCTCATTGCCA

1.5 Western blot檢測

取45 μg總蛋白，95 ℃變性10 min，4%～12% SDS-PAGE電泳分離。電泳結束后，將蛋白從凝膠轉至PVDF膜(0.22 μm，Millipore，美國)上，用5%脫脂奶粉(BD，美國)室溫搖床封閉30 min，分別加入1.5 μg的鼠源β-actin一抗(Abcom，英國，1∶5 000)和兔源SOX5一抗(Abclonal，美國，1∶200)，室溫搖床孵育1 h。隨后TBST洗滌3次，再分別加入2 μg的山羊抗鼠二抗(Abcom，英國，1∶5 000)和山羊抗兔二抗(Abclonal，美國，1∶200)，室溫搖床孵育40 min，TBST洗滌3次。ECL超敏發光液(Coolaber，美國)孵育，Image Quant LAS4000mini儀器(GE，美國)凝膠成像儀器自動曝光，采集圖像。

1.6 免疫組織化學方法

制作不同周齡公雞睪丸組織石蠟切片，二甲苯脫蠟后再進行梯度酒精脫水。枸櫞酸鹽(檸檬酸三鈉)熱修復，然后加3% H2O2室溫孵育，消除內源性過氧化物酶活性。5% BSA封閉1 h，PBS作為陰性對照孵育，加入兔源SOX5一抗(Abclonal，美國，1∶200)室溫孵化1 h，PBS洗滌后再加入山羊抗兔二抗(Abclonal，美國，1∶200)室溫孵化40 min。PBS洗滌后，加DAB顯色2 min，PBS沖洗10 min。再使用蘇木精復染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，鏡檢觀察。

1.7 數據分析

根據熒光定量所得到的Ct值，采用2-△△Ct方法進行處理[12]，利用SAS 8.0軟件對數據進行單因素方差分析，Duncan’s多重比較檢驗組間表達量差異，P<0.05表示差異顯著。Western blot結果使用Image J圖像分析軟件分析，其中SOX5蛋白灰度值為SOX5蛋白IOD值和β-actin IOD值的比值。

2 結 果

2.1 不同周齡公雞睪丸中SOX5 mRNA的表達

如圖1所示，SOX5 mRNA在不同發育階段睪丸中均有表達。隨著周齡的增長，SOX5 mRNA表達量呈現先增長后下降的趨勢，且15周齡睪丸中SOX5 mRNA表達量顯著高于0、5和60周齡(P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)；n=5。下同Different letters mean significant difference (P<0.05); n=5. The same as below圖1 SOX5 mRNA在不同發育階段公雞睪丸中的表達Fig.1 The expression of SOX5 mRNA in the testis of roosters of different ages

2.2 40周齡正常公雞和弱精子癥公雞睪丸中SOX5 mRNA的表達

40周齡弱精子癥公雞睪丸中SOX5 mRNA的表達量是正常公雞的0.38倍，且差異顯著(P<0.05)(圖2)。

2.3 不同周齡公雞睪丸中SOX5蛋白的表達

SOX5蛋白在不同發育階段公雞睪丸中均有表達，0周齡公雞睪丸中，SOX5蛋白表達量最低，15周 齡表達量最高，且呈現先增長后下降的趨勢(圖3)，與mRNA表達結果一致。

圖2 SOX5 mRNA在40周齡正常公雞和弱精子癥公雞睪丸中表達Fig.2 The expression of SOX5 mRNA in the testis of normal and asthenospermia roosters of 40 weeks of age

1～5.0、5、15、40、60周齡1-5.0，5，15，40，60 week圖3 SOX5蛋白在不同發育階段公雞睪丸中表達Fig.3 The expression of SOX5 protein in the testis of roosters of different ages

2.4 40周齡正常公雞和弱精子癥公雞睪丸中SOX5蛋白的表達

40周齡正常公雞睪丸組織中，SOX5的蛋白表達量高于弱精子癥公雞(圖4)，與mRNA結果一致。

圖4 SOX5蛋白在40周齡正常公雞和弱精子癥公雞睪丸中表達Fig.4 The expression of SOX5 protein in the testis of normal and asthenospermia roosters of 40 weeks of age

2.5 不同周齡公雞和40周齡弱精子癥公雞睪丸中SOX5蛋白的表達與定位

在0和5周齡公雞睪丸中，SOX5蛋白只在少量精原細胞和支持細胞中表達(圖5A，B)；15和40周齡公雞睪丸中，SOX5蛋白在支持細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、圓形精子細胞和成熟的精子均表達(圖5C，D)。與40周齡正常公雞睪丸相比，弱精子癥公雞睪丸中SOX5蛋白表達較少(圖5D，E)。

A～D.0、5、15和40周齡正常公雞；E.40周齡弱精子癥公雞；F.陰性對照。a.精原細胞；b.精母細胞；c.圓形精子細胞；d.成熟精子；e.支持細胞A-D.Normal testis at 0, 5, 15, and 40 weeks of age；E. Asthenospermia testis at 40 weeks of age；F.Negative control. a. Spermatogonia; b. Spermatocyte; c. Spermatid; d. Mature sperm; e. Sertoli cell圖5 SOX5在不同發育階段公雞和弱精子癥公雞睪丸組織的免疫組織化學結果(標尺：400 μm)Fig.5 Immunohistochemistry with SOX5 using the immunoperoxidase method and hematoxylin counterstain in the testis of roosters of different ages and asthenospermia roosters of 40 week(Scale bar: 400 μm)

3 討 論

精子鞭毛結構決定精子的運動能力，鞭毛也參與精子的形成過程，因此在精子發生周期中，鞭毛的正確構建較為關鍵[13]。在哺乳動物中，很多精子鞭毛基因已經被驗證[14]。與哺乳動物不同，家禽是內部受精的卵生動物，有儲存精子和多卵受精能力。所以了解其精子形成和活力的調控機理，有助于提高其繁殖能力。前期通過iTARQ蛋白質組學技術篩選出SOX5和SOX9等蛋白在正常公雞和弱精子癥公雞睪丸中表達存在差異[15-16]。

SOX5在哺乳動物睪丸的生殖細胞中表達，并能調節細胞增殖、分化和精子發生等過程[8]。本試驗發現SOX5在剛出生的公雞睪丸中就表達，且隨著周齡的增加，SOX5在睪丸中的表達呈現先上升后降低的趨勢。同時SOX5在睪丸中的表達具有細胞特異性，在支持細胞、精原細胞、各級精母細胞、圓形精子細胞及成熟精子中都存在，且圓形精子細胞中表達量最高。剛出生公雞睪丸中含有大量的支持細胞，而此階段SOX5主要在支持細胞中表達。C.F.Liu等[17]研究發現，SOX5可激活SOX9，而SOX9主要存在睪丸的支持細胞中[18]，參與睪丸細胞增殖分化及維持睪丸功能等過程。SOX5和SOX9在雞胚早期發育時期均表達[19]，對性別分化起決定性作用[20]。SOX5在15周齡公雞睪丸中表達量最高，主要是由于公雞在15周齡時處于性成熟期，睪丸含有大量的圓形精子細胞，并有少量的精子生成；30～50周齡是種雞繁殖高峰期，SOX5表達量維持在較高水平；60周齡時，睪丸萎縮，精子生成減少[21]，這可能是SOX5表達相對較低的原因，本研究中SOX5基因和蛋白隨著公雞周齡增加的表達趨勢與M.Daigle等[5]在小鼠上的研究結果一致。因此，早期發育過程中,SOX5表達量與生精細胞增殖分化有關，性成熟后，其表達量與精子生成呈正相關。

SOX5在40周齡正常公雞睪丸的表達量顯著高于弱精子癥公雞。在生精小管中，精原干細胞增殖分化、精母細胞減數分裂后形成成熟精子。其中CATSPER1、SPAG6和SPAG16基因敲除的細胞肌動蛋白骨架斷裂[22-23]，從而影響纖毛遷移，小鼠精子喪失直線運動能力，精子活力差[24]。SPAG6在精母細胞、圓形精子細胞和成熟精子中均表達，而SOX5通過與CATSPER1和SPAG6等精子活力候選基因的啟動子區域結合，進而調節精子活力[25-27]。因此，SOX5是精子鞭毛功能調節基因，鞭毛結構變化時精子生成、形態和運動都受到影響。由于弱精子癥公雞睪丸初級精母細胞、次級精母細胞、圓形精子細胞和成熟的精子比正常公雞少，所以SOX5在40周齡弱精子癥公雞睪丸的表達顯著低于正常公雞，因此SOX5可以作為弱精子癥潛在的生物標記。

4 結 論

本研究表明，SOX5在公雞各周齡的睪丸組織中均表達， SOX5表達量與生精細胞增殖分化有關；此外，SOX5的表達量可能會影響精子活力。這為進一步研究SOX5對精子發生和睪丸功能調節機制提供參考，也為治療精子活力低下和睪丸損傷等疾病提供理論依據。

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