胞內(nèi)勞森菌LsaA蛋白的原核表達(dá)及間接ELISA抗體檢測方法的建立

吳艷陽，楊東東，高冬生，李永濤，常洪濤，王川慶，趙 軍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

胞內(nèi)勞森菌(Lawsoniaintracellularis)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌，主要寄生在腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)，引起豬的增生性腸炎[1]。臨床上導(dǎo)致發(fā)病豬食欲下降、腹瀉和生長發(fā)育遲緩，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。豬增生性腸炎自1931年被報道以來，已經(jīng)在世界主要養(yǎng)豬國家流行。但由于該病造成的豬死亡率較低，我國對胞內(nèi)勞森菌感染的關(guān)注度并不高，有關(guān)該菌在我國豬群中的流行現(xiàn)狀尚沒有全面和明確的了解。造成這種現(xiàn)狀的主要原因除了關(guān)注度不高之外，更主要的原因是由于檢測方法的欠缺。目前，國內(nèi)外用于診斷胞內(nèi)勞森菌感染的方法主要是血清學(xué)和檢測糞便樣品的各種PCR方法[3-12]。PCR方法雖然具有特異性強(qiáng)、敏感度高等特點，可以實現(xiàn)臨床樣品的快速檢測[13]，但是該方法僅限于感染豬排菌期的糞便樣品檢測，通常還需要特殊的儀器對PCR樣品進(jìn)行后續(xù)分析，不適合大批量樣品的檢測[11]。通過組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)的方法也可以檢查腸上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，但該方法只適用于死后剖檢分析[14]，不適用于早期診斷。血清學(xué)診斷不僅具有較高的敏感性和特異性，且抗胞內(nèi)勞森菌的特異性抗體能夠在體內(nèi)存在更長時間，因此能夠提供更好的檢測替代方法。對于胞內(nèi)勞森菌的血清學(xué)診斷，已有學(xué)者運用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞測定(IPMA)[15]和間接免疫熒光試驗(IFAT)[16]檢測抗胞內(nèi)勞森菌的抗體，但這兩種方法均需要熒光顯微鏡，對人員及設(shè)備的要求較高，而且試驗結(jié)果判定的主觀性較強(qiáng)。因此，亟需建立一種能夠快速、準(zhǔn)確地檢測胞內(nèi)勞森菌特異性抗體的血清學(xué)方法，以便進(jìn)行我國豬群胞內(nèi)勞森菌流行病學(xué)調(diào)查。H. T. Boesen等采用培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森菌的脫氧膽酸鈉提取物作為包被抗原建立了一種檢測胞內(nèi)勞森菌特異性抗體的ELISA方法，所建立的ELISA方法能很好地用于豬增生性腸炎的診斷和豬群中增生性腸炎的流行狀況評價[17]。但胞內(nèi)勞森菌是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌，培養(yǎng)條件要求苛刻[18]，目前世界上僅有少數(shù)實驗室實現(xiàn)了胞內(nèi)勞森菌的分離培養(yǎng)。因此，用培養(yǎng)的胞內(nèi)勞森菌全菌作為診斷抗原存在制備困難和成本高等諸多限制。研究能夠替代胞內(nèi)勞森菌全菌的新型廉價抗原將改進(jìn)現(xiàn)有ELISA方法的不足和促進(jìn)其他檢測方法的建立和推廣。

LsaA是胞內(nèi)勞森菌的一種表面抗原，在細(xì)菌感染過程中合成，參與細(xì)菌的黏附和侵襲。已有研究證明，對豬和小鼠通過口服接種胞內(nèi)勞森菌，可以在其血漿中檢測出抗LsaA蛋白的抗體[19]。利用這一蛋白質(zhì)作為檢測抗原將對胞內(nèi)勞森菌感染的檢測具有直接指示作用。LsaA基因全長為0.7 kb,僅含一個ORF，編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量約為27.4 ku[20]。本研究首次在大腸桿菌中表達(dá)LsaA蛋白，利用純化的重組LsaA蛋白替代胞內(nèi)勞森菌全菌提取物作為包被抗原，以期通過一系列條件的優(yōu)化，初步建立檢測胞內(nèi)勞森菌抗體的間接ELISA方法，為胞內(nèi)勞森菌流行病學(xué)調(diào)查、疫苗免疫效果的評價以及制定有效防控措施提供輔助工具。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌種

原核表達(dá)載體pET32a(+)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實驗室保存，E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京華越洋生物。

1.2 主要試劑和材料

限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG購自Abcam公司；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和Ni-Agarose Resin購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；胞內(nèi)勞森菌陽性血清為利用德國柏林格公司胞內(nèi)勞森菌疫苗免疫胞內(nèi)勞森菌陰性健康豬，采集血液而制備，胞內(nèi)勞森菌陰性血清為采集胞內(nèi)勞森菌陰性健康豬血液分離制備；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽性血清為PEDV和TGEV陰性健康豬經(jīng)PEDV CH/ZMDZY/11株(GenBank登錄號：KC196276)和TGEV Purdue株(GenBank登錄號：AJ271965)滅活疫苗分別免疫后采集血液分離制備；豬霍亂沙門菌陽性血清為豬霍亂沙門菌(菌株號CVCC2139)滅活疫苗免疫豬霍亂沙門菌陰性健康豬采血分離制備，上述材料均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實驗室制備與保存；大腸桿菌(E.coli) K88豬血清由遼寧益康股份有限公司惠贈；96孔酶標(biāo)板購自Corning公司。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中登錄的豬胞內(nèi)勞森菌LsaA基因序列(登錄號:AF498259)，由生工生物工程(上海)股份有限公司優(yōu)化合成LsaA基因，合成基因上游和下游分別帶有NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點，合成基因和pET32a載體分別用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，兩者用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有100 μg·mL-1Amp的LB平板。PCR菌落鑒定陽性的克隆進(jìn)一步測序鑒定，最終得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-LsaA。

1.4 重組LsaA蛋白的表達(dá)與純化

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32a-LsaA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落于含有100 μg·mL-1Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r·min-1，培養(yǎng)至OD600 nm為0.8，加入IPTG至終濃度0.1 mmol·L-1，37 ℃，250 r·min-1振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。離心收集菌體，超聲波破碎菌體。按照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書純化重組目的蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，并經(jīng)SDS-PAGE分析。

1.5 重組蛋白的Western blot 鑒定

將純化后的重組LsaA蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上，將含有LsaA蛋白NC膜切成多條并置于含5%脫脂奶粉的封閉液中4 ℃封閉過夜。分別以豬抗胞內(nèi)勞森菌陽性血清(1∶200稀釋)、胞內(nèi)勞森菌陰性血清、豬流行性腹瀉病毒陽性血清、豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清、豬霍亂沙門菌陽性血清和大腸桿菌K88豬血清為一抗，37 ℃孵育2 h，洗膜后用HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG(1∶5 000稀釋) 為二抗，37 ℃孵育2 h，最后用DAB顯色試劑盒顯色。

1.6 最佳工作濃度與工作條件的確定

1.6.1 抗原最佳包被濃度與血清最佳稀釋度的確定 采用方陣滴定法，將純化的LsaA蛋白用包被稀釋液稀釋為2、4、6、8 μg·mL-1分別加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，每孔100 μL，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，于37 ℃孵育1 h，4 ℃包被過夜；次日棄去包被液，用PBST洗滌3次；在相應(yīng)濃度的抗原孔內(nèi)加入1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋的豬抗胞內(nèi)勞森菌陽性血清和陰性血清，每孔100 μL，37 ℃孵育1.5 h，洗滌3次；每孔加入100 μL 1∶10 000稀釋的兔抗豬IgG-HRP，37 ℃孵育1.5 h，洗滌5次；每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃顯色10 min，每孔加入100 μL終止液(2 mol·L-1H2SO4)終止顯色。在Multiskan Go酶標(biāo)儀(Thermo)上讀取OD450 nm值，比較陽性、陰性血清的OD值，并計算相應(yīng)的陽性血清(P)與陰性血清(N)的OD值的比值(P/N值)，以陽性血清OD450 nm值接近于1.0，且P/N值最大的孔所對應(yīng)的抗原包被濃度和血清稀釋度為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

1.6.2 抗原包被條件和封閉條件的確定 按照“1.6.1”確定的最適包被抗原濃度包被酶標(biāo)板，按照以下3種方式進(jìn)行包被：4 ℃過夜，37 ℃ 1 h后4 ℃過夜，37 ℃ 2 h，然后采用5%脫脂奶和含0.2%吐溫-20的PBS做封閉液封閉抗原孔，37 ℃分別封閉0.5、1、1.5、2 h，隨后按照“1.6.1”條件進(jìn)行ELISA測定，確定最佳抗原包被條件和封閉條件。

1.6.3 酶標(biāo)抗體濃度及其反應(yīng)條件的確定 按上述篩選的條件進(jìn)行試驗，將HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG進(jìn)行1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000稀釋，在37 ℃分別孵育1、1.5和2 h，比較各組陽性血清和陰性血清的OD450 nm值，以陽性血清OD450 nm值接近于1.0，且最大的P/N值所對應(yīng)的酶標(biāo)抗體濃度和反應(yīng)時間作為酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度和反應(yīng)條件。

1.6.4 顯色時間的優(yōu)化 按上述確定的條件進(jìn)行間接ELISA，顯色時間分別為10、15、20、25 min，比較陽性血清和陰性血清的OD450 nm值，并計算P/N值，以陽性血清OD450 nm值接近于1.0，且最大的P/N值所對應(yīng)的顯色時間為最佳顯色時間。

1.7 血清陰陽性臨界值的確定

1.8 特異性與敏感性試驗

用建立的間接ELISA方法檢測大腸桿菌、沙門菌、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒抗血清，同時設(shè)立抗胞內(nèi)勞森菌陰、陽性血清對照，評價方法的特異性。

將胞內(nèi)勞森菌的抗血清作1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200倍比稀釋后，用建立的ELISA方法檢測其中的特異抗體，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)，評價方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗

用同一批次重組蛋白包被酶標(biāo)板，用建立的間接ELISA方法測定5份胞內(nèi)勞森菌陽性血清和5份 陰性血清。另取3個批次的重組蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA檢測，每份血清樣品設(shè)3個重復(fù)，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.10 符合率試驗

收集河南省及周邊省份疑似胞內(nèi)勞森菌感染的發(fā)病豬的血清和相應(yīng)的回腸樣品50份，分別用建立的間接ELISA方法和檢測胞內(nèi)勞森菌病原的PCR方法[6]進(jìn)行平行檢測，并統(tǒng)計分析，比較兩者的符合率。

1.11 臨床血清樣品檢測

用所建立的間接 ELISA 方法對河南省不同地區(qū)豬場送檢的232份來自臨床有腹瀉癥狀的病豬的血清樣品進(jìn)行胞內(nèi)勞森菌抗體檢測，初步了解河南省不同地區(qū)豬群中胞內(nèi)勞森菌的感染和流行情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組胞內(nèi)勞森菌LsaA蛋白的制備

在37 ℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3 h后，pET32a-LsaA/BL21(DE3)表達(dá)的重組蛋白相對分子質(zhì)量約27 ku，與預(yù)期大小一致，應(yīng)用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒能夠有效地純化目的蛋白(圖1A)，經(jīng)Western blot檢測，該蛋白可以與胞內(nèi)勞森菌抗血清特異性結(jié)合，在預(yù)計相對分子質(zhì)量大小位置出現(xiàn)特異性條帶；而不與胞內(nèi)勞森菌陰性血清、豬流行性腹瀉病毒陽性血清、豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清、豬霍亂沙門菌陽性血清和大腸桿菌K88豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1B)。純化后的蛋白用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度為0.38 g·L-1。

2.2 ELISA抗原和抗體的最佳工作濃度和反應(yīng)條件

采用方陣滴定法對不同濃度的包被抗原、包被條件、血清最佳稀釋度、封閉液和封閉條件、酶標(biāo)抗體的工作濃度和反應(yīng)條件，以及顯色液顯色時間等因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，用2 μg·mL-1的重組胞內(nèi)勞森菌LsaA蛋白在37 ℃孵育1 h，然后4 ℃包被過夜，用0.2%吐溫-20的PBS在37 ℃封閉2 h，待檢血清1∶200倍稀釋，與包被抗原37 ℃下反應(yīng)2 h，酶標(biāo)二抗1∶10 000倍稀釋，與待檢血清在37 ℃ 下作用1.5 h，TMB顯色10 min，ELISA的P/N值最大。

2.3 血清陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)

2.4 敏感性和特異性

用建立的方法檢測大腸桿菌、沙門菌、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的抗血清時，OD450 nm值均小于0.239，表明建立的ELISA方法與常見豬腹瀉病原抗血清無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。

敏感性的檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)陽性血清做1∶800倍稀釋時，OD450 nm值為0.353±0.031，高于0.304；當(dāng)1∶1 600倍稀釋時，OD450 nm值為0.206±0.043，低于0.239，所以，該試驗?zāi)軝z出的血清抗體效價為1∶800，具有較好的敏感性。

2.5 重復(fù)性試驗

當(dāng)用同一批次重組LsaA蛋白包被酶標(biāo)板，重復(fù)3次檢測相同血清樣品，或者用3個批次的重組蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA檢測，其變異系數(shù)分別為0.352%～2.752%和0.877%～3.000%，均小于5%，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗的結(jié)果表明，重組LsaA蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA具有很好的重復(fù)性。

A. 豬胞內(nèi)勞森菌重組LsaA蛋白的表達(dá)與純化(M.蛋白質(zhì)低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET32a-LsaA/BL21(DE3)未誘導(dǎo)；2. pET32a-LsaA/BL21(DE3)誘導(dǎo)；3. pET32a-LsaA/BL21(DE3)誘導(dǎo)破菌后上清；4. pET32a-LsaA/BL21(DE3)誘導(dǎo)破菌后沉淀；5.純化的重組LsaA蛋白)；B. 重組LsaA蛋白的Western blot分析(M. 預(yù)染的梯度蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 重組LsaA蛋白與豬抗胞內(nèi)勞森菌陽性血清反應(yīng)性；2. 重組LsaA蛋白與胞內(nèi)勞森菌陰性血清反應(yīng)性；3. 重組LsaA蛋白與豬流行性腹瀉病毒陽性血清反應(yīng)性；4. 重組LsaA蛋白與豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清反應(yīng)性；5. 重組LsaA蛋白與豬霍亂沙門菌陽性血清反應(yīng)性；6. 重組LsaA蛋白與大腸桿菌K88豬血清反應(yīng)性)A.The expression and purification of recombinant Lawsonia intracellularis LsaA protein (M. Low molecular weight protein marker; 1. Non-induced pET32a-LsaA/BL21(DE3) ; 2. Induced pET32a-LsaA/BL21 (DE3) ; 3. Supernatant of induced pET32a-LsaA/BL21(DE3) lysate; 4. Pellet of induced pET32a-LsaA/BL21(DE3) lysate; 5. Purified recombinant LsaA protein); B. Western blot analysis for recombinant L. intracellularis LsaA protein (M. Prestained protein ladder; 1. Reactivity of recombinant LsaA protein against anti-L. intracellularis positive serum; 2. Reactivity of recombinant LsaA protein against anti-L. intracellularis negative serum; 3. Reactivity of recombinant LsaA protein against anti-porcine epidemic diarrhea virus serum; 4. Reactivity of recombinant LsaA protein against anti-transmissible gastroenteritis virus serum; 5. Reactivity of recombinant LsaA protein against anti- Salmonella choleraesuis serum; 6. Reactivity of recombinant LsaA protein against anti-E. coli K88 serum) 圖1 重組胞內(nèi)勞森菌LsaA蛋白的SDS-PAGE與Western blot 分析Fig.1 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant Lawsonia intracellularis LsaA protein

2.6 符合率試驗

利用建立的間接ELISA方法對臨床疑似胞內(nèi)勞森菌感染豬的50份血清樣品進(jìn)行檢測，同時利用針對胞內(nèi)勞森菌LaspA基因的特異性引物進(jìn)行PCR檢測對應(yīng)的50份回腸樣品中的胞內(nèi)勞森菌。結(jié)果顯示，PCR檢測出胞內(nèi)勞森菌陽性回腸樣品50份，ELISA檢測對應(yīng)豬血清中抗胞內(nèi)勞森菌抗體亦為陽性，兩者的符合率為100%。

2.7 臨床血清樣品檢測

用所建立的間接 ELISA 方法對河南省不同地區(qū)豬場送檢的232份來自臨床有腹瀉癥狀的病豬的血清樣品進(jìn)行胞內(nèi)勞森菌抗體檢測，232份豬血清樣品共有71份顯示為胞內(nèi)勞森菌抗體陽性，陽性率在13.3%～57.1%，平均陽性率為30.6%(表1)。

3 討 論

由專性細(xì)胞內(nèi)寄生的胞內(nèi)勞森菌引起的豬增生性腸炎自1931年首次被報道以來，目前已經(jīng)分布于世界各主要養(yǎng)豬國家，成為集約化養(yǎng)殖場常見疾病之一。肖愛歡等首先報道了豬增生性腸炎在我國的流行[21]。由于該病臨床上導(dǎo)致的豬死亡率不高和受到檢測方法的限制，對于該病在我國豬群中的流行情況至今沒有全面的了解。目前用于糞便樣品和腸道組織中檢測胞內(nèi)勞森菌的各類PCR方法和基于血清學(xué)的免疫熒光技術(shù)，受到排菌期和特定儀器設(shè)備的限制，較難實現(xiàn)對臨床大量樣品的檢測。此外，PCR并不能區(qū)分糞便中的胞內(nèi)勞森菌是否有活性，從糞便中檢測到胞內(nèi)勞森菌并不能說明豬正感染著細(xì)菌，檢測到胞內(nèi)勞森菌DNA也并不能說明

表1河南省部分地區(qū)胞內(nèi)勞森菌血清學(xué)調(diào)查情況

Table1SeroepidemiologicalsurveyofL.intracellularisinfectioninpartialregionsofHenanprovince

血清來源Sourceofserum樣品數(shù)No.ofsamples陽性Positive陰性Negative陽性率/%Positiverate信陽Xinyang2442016.7駐馬店Zhumadian3592625.7南陽Nanyang56322457.1周口Zhoukou1521313.3商丘Shangqiu2031715.0新鄉(xiāng)Xinxiang1851327.7洛陽Luoyang2261627.3平頂山Pingdingshan123925.0鄭州Zhengzhou3072323.3合計Total2327116130.6

該細(xì)菌就是引起腹瀉的原因。但胞內(nèi)勞森菌感染豬后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，且抗體通常能在機(jī)體內(nèi)存在相當(dāng)長的時間。LsaA作為胞內(nèi)勞森菌的一種表面蛋白，參與細(xì)菌的黏附和侵襲，而且在感染動物血漿中可以檢測出抗LsaA蛋白的抗體[19]。因此，利用這一蛋白作為檢測抗原建立間接ELISA檢測針對胞內(nèi)勞森菌的特異性抗體，不僅克服了現(xiàn)有其他檢測方法的局限，而且檢測結(jié)果可以作為胞內(nèi)勞森菌前期感染的指示。借助大型ELISA工作站等平臺可以實現(xiàn)大量臨床血清樣品的快速、準(zhǔn)確檢測。

胞內(nèi)勞森菌是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌，其培養(yǎng)條件要求苛刻，國內(nèi)尚未見成功分離培養(yǎng)該菌的報道，國外已經(jīng)有用胞內(nèi)勞森菌全菌裂解物作為抗原研發(fā)的檢測胞內(nèi)勞森菌抗體的試劑盒，但價格昂貴。用該試劑盒檢測臨床大量血清樣品，進(jìn)行胞內(nèi)勞森菌血清流行病學(xué)調(diào)查的成本很高。國內(nèi)張曙儉和劉磊分別以胞內(nèi)勞森菌外膜蛋白OMP作為抗原建立了ELISA方法[12, 22]，但未見后期臨床應(yīng)用的報道。本試驗原核表達(dá)了胞內(nèi)勞森菌表面蛋白LsaA。Western blot分析結(jié)果顯示，表達(dá)的重組LsaA蛋白與胞內(nèi)勞森菌陽性血清具有良好的免疫反應(yīng)性，而與胞內(nèi)勞森菌陰性血清和其他豬腹瀉病原抗血清均不發(fā)生特異性反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，用純化的LsaA蛋白替代胞內(nèi)勞森菌全菌裂解物作為包被抗原建立了檢測胞內(nèi)勞森菌抗體的間接ELISA，所建立ELISA方法特異性良好，檢測抗PEDV、TGEV、大腸桿菌、沙門菌陽性血清均無交叉反應(yīng)；敏感性也較高，陽性血清1∶800稀釋，P/N值仍在陽性范圍；批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗顯示所建立ELISA重復(fù)性良好。對臨床上疑似胞內(nèi)勞森菌感染豬血清樣品的檢測結(jié)果與胞內(nèi)勞森菌病原檢測結(jié)果一致，說明所建方法具有較高的可靠性和準(zhǔn)確性，可用于胞內(nèi)勞森菌感染期的診斷和血清流行病學(xué)調(diào)查。

在成功建立檢測胞內(nèi)勞森菌抗體間接ELISA方法的基礎(chǔ)上，本試驗對河南省內(nèi)部分地區(qū)豬場送檢的臨床有腹瀉癥狀豬的血清樣品進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果顯示，河南省內(nèi)被檢豬場均存在胞內(nèi)勞森菌抗體陽性豬，其中河南南陽地區(qū)送檢樣品陽性率最高，高達(dá)57.1%，具體原因尚待進(jìn)一步確定。通過樣品溯源了解到南陽地區(qū)送樣豬場的育肥豬確實存在排水泥樣和帶血稀糞，部分豬生長狀況不佳的情況。從上述送檢樣品豬場采集的糞便樣品經(jīng)PCR檢測也確為胞內(nèi)勞森菌陽性，因長期便血而衰竭死亡豬的死后剖檢也呈現(xiàn)典型的豬回腸炎病變。上述結(jié)果也在一定程度上反映了本試驗所建立ELISA方法用于胞內(nèi)勞森菌感染情況的血清流行病學(xué)調(diào)查的可靠性。

4 結(jié) 論

成功表達(dá)胞內(nèi)勞森菌表面蛋白LasA，并建立基于LsaA蛋白的間接ELISA方法，該方法檢測胞內(nèi)勞森菌抗體與其他常見豬腹瀉病病原抗血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，對胞內(nèi)勞森菌感染陽性豬的檢測結(jié)果與PCR檢測病原結(jié)果有很高的符合率，敏感性和重復(fù)性良好。應(yīng)用建立的ELISA方法對河南省部分地區(qū)豬場胞內(nèi)勞森菌的感染情況進(jìn)行了血清流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示被檢地區(qū)豬場均存在不同程度的胞內(nèi)勞森菌抗體陽性，提示養(yǎng)豬業(yè)應(yīng)提高對胞內(nèi)勞森菌感染的重視度，加強(qiáng)血清學(xué)監(jiān)測，及早采取有效措施控制胞內(nèi)勞森菌感染在我國的流行。

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