捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半胱氨酸蛋白酶對山羊PBMCs免疫功能的影響

胡孟娟，周麗娜，牛延萍，徐立新，宋小凱，李祥瑞，嚴(yán)若峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲寄生于牛、羊、駱駝等反芻動物皺胃，吸食宿主血液，繁殖力高，流行廣泛，致病性強(qiáng)[1]。宿主感染該病原易引起嚴(yán)重胃炎、貧血、腹瀉等[2]，大量感染致使幼齡動物死亡，對全世界畜牧業(yè)產(chǎn)生巨大威脅，并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，研究并開發(fā)出一種有效的疫苗來防治該病尤為重要。隨著各方面研究的深入，人們逐步認(rèn)識到，要想研制有效的疫苗，必須深入了解捻轉(zhuǎn)血矛線蟲寄生過程中的一些重要問題，包括線蟲侵入宿主機(jī)制、消化道附著機(jī)制、吸血機(jī)制和免疫抑制機(jī)制等[4]。

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease，CP)是一類重要的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶，在生物進(jìn)化過程中非常保守，其活性中心含有半胱氨酸殘基，廣泛存在于各種生物體中[5]。近年來對寄生蟲半胱氨酸蛋白酶研究頗多，如弓形蟲、旋毛蟲、肝片吸蟲等，研究發(fā)現(xiàn)該酶參與寄生蟲攝取營養(yǎng)、免疫逃避、在宿主體內(nèi)移行等過程，是一種良好的疫苗候選抗原。利用Race技術(shù)克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半胱氨酸蛋白酶(Hc58)，并對其序列和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因全長序列為851 bp，編碼217個氨基酸，該蛋白質(zhì)屬于木瓜蛋白酶類的C1族組織蛋白酶B樣蛋白酶，可能在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的食血過程和在宿主體內(nèi)存活起到重要作用[6]。同時構(gòu)建了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc58 DNA疫苗，并進(jìn)行了山羊免疫保護(hù)性試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)每克糞便蟲卵數(shù)、蟲卵孵化率和皺胃荷蟲數(shù)比對照組分別減少了28.02%、47.6%和28.3%，結(jié)果表明Hc58 DNA疫苗具有較好的免疫保護(hù)效果[7]。本試驗(yàn)通過體外試驗(yàn)分析Hc58對山羊PBMCs的影響，結(jié)果對了解該蛋白質(zhì)誘導(dǎo)宿主免疫保護(hù)機(jī)制具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 3～6月齡健康山羊，購自南京某郊區(qū)養(yǎng)殖場。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種 pET-28a-Hc58質(zhì)粒，大腸桿菌BL21均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要工具酶和試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司；Pierce?BCA Protein Assay Kit蛋白定量分析試劑盒購于美國 Thermo公司；淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊锕井a(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基及胰酶消化液均購于Gbico公司；胎牛血清購自Life technologies公司；12孔、24孔、96孔Costar?細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司；E.Z.N.ATMTotal RNA kit I為OMEGA公司產(chǎn)品；總一氧化氮檢測試劑盒購自碧云天公司；Millcell?Hanging Cell Culture Inserts購自Merck-Millipore公司；HiScriptTMQ RT SuperMix for qPCR試劑盒、ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix均購于南京諾唯贊公司；Annexin V-FITC Kit購自南京福麥斯生物公司；FITC-dextran為美國Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 ImageQuant300凝膠成像分析系統(tǒng)(美國GE公司)，5417R冷凍臺式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，Thermo Scientific 8000 CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)，ABI7500熒光定量PCR儀，PCR擴(kuò)增儀(日本TaKaRa)，BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(美國Bectom Dickinson公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的鑒定與表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取單菌落，提取質(zhì)粒用BamHⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒送去南京擎科生物公司進(jìn)行測序。將測序正確的菌液接種于含1 μg·mL-1Kana抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，次日以1∶100接種于1 000 mL液體LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫?fù)u床180 r·min-1搖至OD600 nm值為0.4～0.6，加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol·L-1繼續(xù)誘導(dǎo)5 h。收集菌體，超聲破碎，SDS-PAGE檢測菌體分布在上清或包涵體。

1.2.2 重組蛋白質(zhì)的純化 參照說明書使用鎳柱吸附蛋白質(zhì)原理對重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測后，將重組蛋白質(zhì)放入含梯度濃度尿素的復(fù)性緩沖液中分別復(fù)性透析8 h，經(jīng)聚乙二醇濃縮后，測定濃度，過濾除菌分裝凍存。

1.2.3 山羊PBMCs和單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 從健康山羊頸靜脈中無菌采取抗凝血，參照淋巴細(xì)胞分離液說明書分離PBMCs。臺盼藍(lán)染色觀察活細(xì)胞在95%以上。將收集的PBMCs用含1%的雙抗和10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液吹懸混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106·mL-1。單核細(xì)胞具有貼壁生長的特性，由此可進(jìn)行分離。將分離的PBMCs或單核細(xì)胞與終質(zhì)量濃度為0、10、20、40 μg·mL-1的重組蛋白質(zhì)Hc58共孵育，置于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 重組蛋白質(zhì)對單核細(xì)胞分泌一氧化氮的影響 取“1.2.3”處理好的單核細(xì)胞懸液，每孔1 mL，分別加入24孔板中，并設(shè)置pET-28a標(biāo)簽蛋白對照組，每組三個重復(fù)。培養(yǎng)24 h后，離心取細(xì)胞上清，按照碧云天總NO檢測說明書進(jìn)行測定。

1.2.5 重組蛋白質(zhì)對山羊單核細(xì)胞吞噬能力的影響 將“1.2.3”處理好的單核細(xì)胞接種于24孔板中，每孔1 mL，同時設(shè)置pET-28a標(biāo)簽蛋白對照組，每組三個重復(fù)。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，每管加入1 mL預(yù)冷的PBS溶液洗滌，用100 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，再加入100 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(FITC-dextran)，混勻，分別置于4和37 ℃避光孵育1 h；用預(yù)冷的含2% FBS的PBS溶液洗滌，再用500 μL PBS溶液重懸細(xì)胞；轉(zhuǎn)入流式管中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。參照文獻(xiàn)[8]細(xì)胞吞噬指數(shù)(cell phagocytosis index，PI)計(jì)算公式PI=MFI試驗(yàn)組/MFI細(xì)胞對照組對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.2.6 重組蛋白質(zhì)對PBMCs分泌細(xì)胞因子的影響 取24孔板，每孔1 mL加入“1.2.3”處理好的PBMCs細(xì)胞懸液，設(shè)置pET-28a標(biāo)簽蛋白對照組，每組三個重復(fù)。培養(yǎng)24 h后，參照總RNA提取試劑盒說明書對細(xì)胞RNA進(jìn)行提取，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)并合成山羊細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β的引物，以β-actin為內(nèi)參，采用熒光定量PCR對山羊PBMCs細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定。

1.2.7 重組蛋白質(zhì)對PBMCs遷移的影響 取24孔板，每孔加入“1.2.3”處理好的PBMCs細(xì)胞懸液1 mL，同時設(shè)置pET-28a標(biāo)簽蛋白對照組，每組三個重復(fù)，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；再嵌入遷移小室，培養(yǎng)2 h后，收集遷移至下室的細(xì)胞，經(jīng)過計(jì)數(shù)，算出細(xì)胞的遷移率。

1.2.8 重組蛋白質(zhì)對PBMCs凋亡的影響 于24孔板中分別加入“1.2.3”處理好的PBMCs細(xì)胞懸液1 mL，并設(shè)置pET-28a標(biāo)簽蛋白對照組，每組三個重復(fù)。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞于1.5 mL Eppendorf管中，500 g離心5 min，棄上清；用預(yù)冷的1×Binding Buffer洗滌兩遍；100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞；再加入10 μL Annexin V-FITC；輕輕吹打混勻，避光孵育15 min；再用1×Binding Buffer洗滌兩遍，棄上清，加入500 μL 1×Binding Buffer和5 μL碘化丙啶(propidium iodide)，輕輕混勻，轉(zhuǎn)入流式管，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc58的鑒定表達(dá)與純化

重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Hc58經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切鑒定，顯示有一條載體條帶和一條850 bp左右的目的片段，結(jié)果與預(yù)測相符。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白主要以包涵體的形式存在，獲得的融合蛋白相對分子質(zhì)量約為27 ku(圖1)。

2.2 重組蛋白質(zhì)對山羊單核細(xì)胞分泌NO的影響

單核細(xì)胞與不同濃度的重組蛋白Hc58作用后，在質(zhì)量濃度為20和40 μg·mL-1時，能顯著(P<0.01或P<0.001)增強(qiáng)單核細(xì)胞分泌NO，而在質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1時，影響不明顯(圖2)。本研究中，pET-28a標(biāo)簽蛋白對照組與細(xì)胞對照組無顯著差異，說明融合蛋白質(zhì)中標(biāo)簽蛋白對試驗(yàn)無影響。

2.3 重組蛋白質(zhì)對山羊單核細(xì)胞吞噬能力的影響

與細(xì)胞對照組相比，試驗(yàn)組中3種質(zhì)量濃度的重組蛋白質(zhì)Hc58均能顯著(P<0.01或P<0.001)促進(jìn)山羊單核細(xì)胞的吞噬能力(圖3)。

2.4 重組蛋白質(zhì)對山羊PBMCs分泌細(xì)胞因子的影響

重組蛋白質(zhì)Hc58刺激PBMCs后，3個試驗(yàn)組中，IL-2、IL-4、IL-17轉(zhuǎn)錄量均顯著(P<0.01或P<0.001)高于細(xì)胞對照組；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度為10和20 μg·mL-1時， IFN-γ轉(zhuǎn)錄量極顯著(P<0.001)高于細(xì)胞對照組，而IL-10、TGF-β變化不明顯(圖4)。

2.5 重組蛋白質(zhì)對山羊PBMCs遷移能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，3種濃度的重組蛋白質(zhì)Hc58與PBMCs作用后，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20和40 μg·mL-1時，能顯著(P<0.01或P<0.001)促進(jìn)山羊PBMCs的遷移，作用效果隨著Hc58的濃度增加而增強(qiáng)(圖5)。

2.6 重組蛋白質(zhì)對山羊PBMCs凋亡的影響

本試驗(yàn)中，PBMCs經(jīng)不同濃度的Hc58作用后，細(xì)胞凋亡的比例呈劑量依賴性。其中，20和40 μg·mL-1的重組蛋白質(zhì)能極顯著的促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.001)(圖6、圖7)。

A.重組質(zhì)粒pET-28a-Hc58的雙酶切鑒定(M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-28a-Hc58經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ的酶切產(chǎn)物)；B.重組蛋白Hc58的分布(M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.表達(dá)產(chǎn)物上清；2.表達(dá)產(chǎn)物沉淀)；C.重組蛋白Hc58的純化(M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化前包涵體蛋白；2.純化后包涵體蛋白)A. Identification of recombinant plasmid pET-28a-Hc58 by restriction enzyme digestion (M. DNA marker; 1.pET-28a-Hc58 digested by BamHⅠand Hind Ⅲ); B. Distribution of recombinant Hc58 (M. Protein marker; 1.Supernatant of expression products; 2.Precipitate of expression productions); C. Purification of recombinant Hc58(M.Protein marker; 1.Inclusion body without purification; 2.Purified protein from inclusion body)圖1 Hc58基因的鑒定表達(dá)與蛋白質(zhì)純化Fig.1 Identification, expression and purification of recombinant Hc58

與細(xì)胞對照組(0 μg·mL-1)相比，**.P<0.01；***.P<0.001。下圖同Compared with the control group (0 μg·mL-1),**.P<0.01; ***.P<0.001. The same as follow圖2 重組蛋白質(zhì)Hc58對山羊單核細(xì)胞分泌NO的影響Fig.2 Effect of recombinant Hc58 on the NO production of goat monocytes

圖3 重組蛋白質(zhì)Hc58對山羊單核細(xì)胞吞噬功能的影響Fig.3 Effect of recombinant Hc58 on the phagocytosis of goat monocytes

3 討 論

尋找具有免疫保護(hù)效果的蟲體抗原是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗研究的一個重要方向。研究發(fā)現(xiàn)一些膜內(nèi)分泌蛋白，尤其是酶類，不僅具有很強(qiáng)的抗原性，而且在同一蟲體的不同發(fā)育時期均有分泌，參與蟲體的入侵、吸附、繁殖、免疫逃避等過程，并在寄生蟲與宿主之間的相互作用中扮演重要角色[10]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半胱氨酸蛋白酶Hc58分布于腸微絨毛表面，具有血凝活性，可降解山羊血紅蛋白、IgG和纖維蛋白原，具有顯著的免疫原性[11]。

圖4 重組蛋白質(zhì)Hc58影響山羊PBMCs多種細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄情況Fig.4 The mRNA transcriptional level of multiple cytokines in PBMCs of goat stimulated by recombinant Hc58

圖5 重組蛋白質(zhì)Hc58對山羊PBMCs遷移的影響Fig.5 Effect of recombinant Hc58 on the migration of goat PBMCs

外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)指外周血中具有單個核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，是免疫系統(tǒng)功能研究的重要成分[12]。筆者從細(xì)胞吞噬、遷移等幾個方面進(jìn)一步研究重組蛋白Hc58對PBMCs免疫功能的影響，為闡釋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲與宿主之間的免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

NO是體內(nèi)重要的信使分子，參與細(xì)胞殺傷、內(nèi)分泌激素的釋放等過程，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。研究表明，NO在機(jī)體抵抗錐蟲、瘧原蟲、血吸蟲、利什曼原蟲等大多數(shù)寄生蟲感染過程中發(fā)揮重要作用[14]。吳玲燕等[12]研究表明，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組蛋白NDUDC刺激山羊PBMCs能夠促進(jìn)NO的分泌，且呈劑量依賴性。而本試驗(yàn)中，20和40 μg·mL-1重組蛋白質(zhì)Hc58刺激單核細(xì)胞后，也能顯著促進(jìn)單核細(xì)胞釋放NO。而且單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞被活化后，吞噬能力增強(qiáng)，能清除體內(nèi)病原體和損傷的細(xì)胞[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組蛋白質(zhì)Hc58能顯著增強(qiáng)單核細(xì)胞的吞噬功能，加強(qiáng)了機(jī)體的防御能力。

Th1、Th2類免疫和炎癥反應(yīng)分泌的細(xì)胞因子在抵抗寄生蟲感染中起重要的作用[16]。IL-2和IFN-γ由Th1類細(xì)胞分泌，IL-4由Th2類細(xì)胞分泌。IL-2可刺激T細(xì)胞增殖而增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性。IFN-γ可刺激巨噬細(xì)胞活化，增強(qiáng)其抗原提呈能力。IL-4可促進(jìn)B細(xì)胞的生長增殖及分泌IgE抗體[17]。IL-17由Th17類細(xì)胞分泌，主要是在機(jī)體受到真菌或其他外源物質(zhì)攻擊時通過在感染部位募集中性粒細(xì)胞發(fā)揮作用[18]。而IL-10和TGF-β則由Treg細(xì)胞分泌，TGF-β則可能是機(jī)體關(guān)閉免疫應(yīng)答的信號，對各類免疫細(xì)胞均具有抑制作用[19]。Y. L. Wen等[15]和M. Ehsan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組蛋白Miro-1、精氨酸激酶可通過Th1、Th2和Th17來調(diào)節(jié)寄生蟲與宿主之間的免疫應(yīng)答，其中Th2類免疫占主導(dǎo)作用。而本試驗(yàn)中IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-17轉(zhuǎn)錄水平變化明顯，IL-10、TGF-β變化不明顯，且20 μg·mL-1重組蛋白Hc58試驗(yàn)組IL-2、IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P<0.001)，變化最為明顯，表明Hc58可誘導(dǎo)Th1、Th2、Th17類細(xì)胞分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)宿主的免疫功能，且主要誘導(dǎo)Th1類免疫反應(yīng)。

圖6 雙染流式分析Fig.6 The flow cytometry picture showed double staining by Annexin V-FITC and Propidium iodide

圖7 重組蛋白質(zhì)Hc58對山羊PBMCs凋亡的影響Fig.7 Effect of recombinant Hc58 on the apoptosis of goat PBMCs

細(xì)胞遷移是機(jī)體正常發(fā)育和生理活動的基礎(chǔ)，在胚胎發(fā)育、免疫防御、損傷修復(fù)以及腫瘤轉(zhuǎn)移等許多生理和病理過程中發(fā)揮核心作用[20]。當(dāng)宿主感染病原體時，為了防止其入侵，免疫細(xì)胞會向感染部位遷移，參與機(jī)體的免疫防御。本次試驗(yàn)表明，高濃度的Hc58能顯著增加PBMCs的遷移率，有利于機(jī)體清除病原菌和有害物質(zhì)。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動性死亡過程，受多種基因的調(diào)控，對疾病的預(yù)防與診治有著重要的意義。本研究中作者發(fā)現(xiàn)重組蛋白Hc58能顯著誘導(dǎo)山羊PBMCs的凋亡，對促進(jìn)衰老損傷細(xì)胞的清除、生物體進(jìn)化、機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持等有著重要作用。本試驗(yàn)僅初步研究了重組蛋白質(zhì)對PBMCs凋亡的作用，至于其如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制和信號傳導(dǎo)途徑尚不清楚，有待于深入探索。

本文通過重組蛋白質(zhì)Hc58與山羊PBMCs共同作用，體外試驗(yàn)測定其部分免疫指標(biāo)，了解到該蛋白質(zhì)對PBMCs發(fā)揮免疫功能具有重要意義，后續(xù)會通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步研究Hc58對山羊免疫保護(hù)機(jī)制的影響。

4 結(jié) 論

體外試驗(yàn)表明重組蛋白質(zhì)Hc58具有促進(jìn)NO分泌和細(xì)胞的吞噬作用，上調(diào)IL-2、IL-4、IL-17和IFN-γ的表達(dá)，顯著增強(qiáng)細(xì)胞遷移和凋亡，可通過多種途徑影響山羊PBMCs免疫功能的發(fā)揮。

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