補腎強骨湯治療糖尿病性骨質疏松大鼠模型療效研究*

王 菲，婁 靜

河南省中醫藥研究院附屬醫院(鄭州 450000)

糖尿病性骨質疏松癥(Diabetic osteoporosis，DOP)是指2型糖尿病(T2DM)合并骨強度減弱、骨脆性增高、單位體積的骨量減少以及骨組織的細微結構變化等系列全身性骨質病變[1-3]。DOP是T2DM的一項重要且多發的骨骼系統并發癥，DOP患者骨折損傷的風險顯著提高，且發生骨損傷后易出現愈合困難等繼發性傷害[4-6]。西醫治療本病主要以控制血糖、增強骨密度等對癥治療為主。對于改善患者主要癥狀雖有一定效果，但對于患者體質與致病環境療效無法滿足治療要求，因此易出現復發且長期用藥不良反應較高。中醫理論認為腎為骨之源；T2DM為消渴之癥主要因為腎虛所致，因此二病同源，治療時應從腎論治。我們在中醫理論的基礎上制定出補腎強骨湯治療本病，為了客觀評估其對DOP的療效，開展本次動物實驗，現將具體情況于下文詳細闡述。

材料與方法

1 實驗試劑與儀器 使用儀器：使用羅氏自動型生化分析儀，MEDILINK公司出品的雙能X線骨密度檢測儀。使用試劑：美國Sigma出品的鏈脲佐菌素。自擬補腎強骨湯方劑組成：山萸肉24 g，生地、熟地、金毛狗、菟絲子、補骨脂各15 g，牛膝、續斷各12 g，地龍、甘草各10 g；均購自同仁堂中藥飲片公司。安慰劑：屈臣氏蒸餾水。實驗動物：購自鄭州大學實驗動物中心，月齡3個月的SPF級雄性SD大鼠60只。

2 造模方法 全部大鼠均于18～22 ℃，濕度40%～50%，自然照明，定期通風換氣的實驗室內飼養。自上述60只大鼠中隨機選取10只納入空白組，給予標準飼料常規喂養，自由飲食。其余50只大鼠制備為DOP模型，以高糖高脂飼料喂養，飼料配制：常規飼料為基礎，加入20%的蔗糖、15%的熟豬油、2.5%的膽固醇，喂養4周；禁食正常飲水12 h后，給予鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg于左下腹部處注射。腹腔注射 STZ后持續高脂高糖飼料喂養6周，之后采集尾靜脈血樣。化驗血糖水平≥16.7mmol/L時為T2DM造模成功[7]。T2DM大鼠持續高脂高糖喂養7周后，以雙能X線骨密度檢測儀進行BMD 測量。BMD檢測時，依據35 mg/kg體重劑量給予戊巴比妥鈉，腹腔注射麻醉，使大鼠取仰臥位，四肢充分外展，使骨骼均在掃描窗內避免重疊。以BMD<空白組BMD均值的2.5個標準差的T2DM大鼠為DOP大鼠造模成功標準[7]。

3 分組與干預方法 于全部DOP造模成功的大鼠中隨機選取30只，均分后分別納入模型組、陽性對照組及觀察組，每組各10只。觀察組給予自擬補腎強骨湯治療，將補腎強骨湯以水煎取湯汁，按15g/kg體重劑量給予灌胃，1次/d，持續12周。模型組不予任何治療干預措施。陽性對照組給予與觀察組同等劑量的蒸餾水(安慰劑)灌胃，持續12周。

4 檢驗方法 各組均于觀察組與陽性對照組干預治療12周后，同時采取腹主靜脈血樣3 ml，靜置30 min后，以3000 r/min速度離心10 min，分離血清，使用全自動生化分析儀檢測空腹血糖、空腹胰島素、血鈣、血磷、堿性磷酸酶、BMD、IGF-1、TNF-α表達水平。

5 統計學方法 實驗所得數據錄入至SPSS 19.0軟件當中，以單因素ANOVA分析各組間數據的差異性，進一步兩兩對比以LSD-L分析；P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 空腹血糖及胰島素水平比較 見表1。模型組、陽性對照組、觀察組大鼠空腹血糖、空腹胰島素與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組與陽性對照組比較，差異有統計學意義(P>0.05)；觀察組空腹血糖低于模型組、陽性對照組，空腹胰島素高于模型組、陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 四組空腹血糖及胰島素檢測對比(mmol/L)

注：與空白組對比,★P<0.05;與模型組對比,☆P<0.05;與陽性對照組對比,▲P<0.05

2 血鈣、血磷、堿性磷酸酶及BMD比較 見表2。模型組、陽性對照組、觀察組大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶及BMD與空白組均具有差異(P<0.05)；模型組與陽性對照組無差異(P>0.05)；觀察組血鈣、血磷、堿性磷酸酶及BMD均優于模型組與陽性對照組(P<0.05)。

表2 四組血鈣、血磷、堿性磷酸酶及BMD對比

注：與空白組對比,★P<0.05;與模型組對比,☆P<0.05;與陽性對照組對比,▲P<0.05

3 血清IGF-1、TNF-α表達水平比較 見表3。模型組、陽性對照組、觀察組大鼠血清IGF-1、TNF-α表達水平與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組與陽性對照組比較，差異有統計學意義(P>0.05)；觀察組IGF-1、TNF-α表達水平均優于模型組與陽性對照組(P<0.05)。

表3 四組IGF-1、TNF-α表達水平對比

注：與空白組對比,★P<0.05;與模型組對比,☆P<0.05;與陽性對照組對比,▲P<0.05

討 論

近些年來，我國經濟飛速發展，國民收入水平顯著提高，飲食結構也隨之出現較大改變，加之遺傳因素等多種因素導致我國T2DM的發病率逐年上升[8]。目前T2DM已經引起全社會的廣泛關注。骨質疏松作為T2DM在骨骼系統的重要并發癥應給予足夠重視。T2DM可誘發骨質疏松，骨質疏松又直接加大了患者骨折傷害的風險，骨折損傷可對患者的生活質量造成較大的不良影響，同時T2DM亦增加了骨質疏松性骨折患者骨愈合的難度[9-10]。因此探尋DOP的理想治療方案對于醫患雙方均具有重要意義。有研究表明黃芪、骨碎補等中藥對于DOP大鼠的成骨細胞、IGF-1等多項細胞因子均具有明確的改善作用[11-13]。IGF-1是骨生長的一項重要因子，直接作用于機體的骨原細胞，可促進DNA合成成骨細胞及其分化，提高成骨細胞總量。IGF-1還可經由拮抗骨膠原的降解發揮調整骨吸收量的作用，可維持骨量的動態平衡。IGF-1表達的異常降低說明骨礦化的速度減低，或者成骨細胞的活性減弱，提示骨形成的減少。因此IGF-1可作為骨質疏松的一項血清標志物。DOP以T2DM為基礎，增加了慢性炎癥的風險，TNF-α作為一項重要的炎性標志物，其升高表達可提示機體炎性反應的程度，炎性病理反應可加大骨礦物丟失的風險。因此TNF-α表達水平可作為DOP的一項輔助評估指標。

中醫學理論認為DOP屬于“消渴、骨痿”的范疇[14]。消渴為根而骨痿則為標[15]。消渴癥的成因為腎虛內燥致使的脈絡瘀滯，這一致病機理與骨痿病機是一致的，因此二病同源均應從“腎”論治。治療應以補腎、化瘀、潤燥、強骨為原則。我們在中醫理論的基礎上擬定出補腎強骨湯治療本病，方中生地甘寒清熱，質潤養陰，有清熱涼血、養陰生津，通便潤腸功效，對消渴病的陰虛證有很好的療效。熟地微溫、味甘質潤、入肝腎經，可滋陰補血、養血，以補精益髓功效為主，主治消渴以及精血虧虛之腰酸、骨軟腳弱等癥。山萸肉入肝腎經，有補益肝腎,固脫收斂功效，主治消渴，尿頻數、虛汗頻頻。金毛狗脊具有滋補肝腎、強筋骨、抗風濕、壯腰膝作用，對于風濕疼痛以及肝腎虧虛癥效果顯著。菟絲子入肝腎經，益氣力、補不足、堅筋骨，可添精益髓，主治消渴熱證、助人筋脈、去腰疼膝冷。補骨脂治療腎陽不足的腰膝冷痛、溫下元治虛冷尿頻。牛膝入于肝腎經，性善下行。具有補肝腎、通血脈、強筋骨、利關節作用。續斷味苦，性辛微溫，有補肝益腎、強健筋骨，療傷續折功效，主治腰膝酸痛，跌打損傷。地龍性味咸寒，通絡止痛，具有良好的改善微循環作用，還可治消渴病，有降血糖作用。甘草清熱解毒，調和諸藥。

本次研究旨在分析上述自擬補腎強骨湯對于DOP的治療作用。通過動物實驗證明，模型組、觀察組、陽性對照組與空白組之間血糖水平、胰島素水平以及血磷、血鈣、堿性磷酸酶及BMD均具有明確差異性，證明DOP建模成功。以自擬補腎強骨湯灌胃12周后，觀察組大鼠各項觀察指標均優于陽性對照組與模型組，而以安慰劑灌胃的陽性對照組則與模型組無差異，充分的說明了自擬補腎強骨湯對于DOP大鼠具有明確的治療作用，但觀察組各項觀察指標與空白組間依然存在差異性。觀察組治療12周后 IGF-1可見明顯回升，TNF-α可見明顯下降，兩項指標的表達水平明顯優于模型組與陽性對照組，但與空白組仍具有差異性。上述研究數據對比結果說明以自擬補腎強骨湯單純灌胃治療12周尚不能達到完全治愈的療效，但對于DOP大鼠具有明確療效。

綜上所述，自擬補腎強骨湯對于DOP具有明確療效，但單純治療12周尚無法完全治愈。提示臨床應用過程中可聯合西藥進行治療以提高臨床療效或縮短療程。

[1] 屈 強,朱 超,彭翠寧.運動對去勢雌性大鼠不同部位骨密度影響實驗研究[J].陜西醫學雜志,2014,43(11):1462-1464.

[2] Jin HS,Kim J,Park S,etal.Association of the I264TVariant in the Sulfide Quinone Reductase-Like(SQRDL) genewith osteoporosis in Korean postmenopausal women[J].PLoSOne,2015,10(8):e0135285-e0135285.

[3] Soubhye J,Alard IC,Antwerpen Pv,etal.Type 2 17-βhydroxysteroid dehydrogenase as a novel target for the treat-ment of osteoporosis[J].Future Med Chem,2015,7(11):1431-1456.

[4] 陳 珺,楊 力,麥靜娥,等.沙格列汀和艾塞那肽對糖尿病性骨質疏松大鼠松質骨的影響[J].中國藥學雜志,2016,51(12):976-980.

[5] 粟 麟,李雙蕾,陳文輝,等.壯骨方對糖尿病大鼠骨質疏松的防治及其對血清IGF-1、TNF-α水平的影響[J].中國骨質疏松雜志,2016,22(4) :428-432.

[6] 莫文秋,陳文輝,李雙蕾.壯骨方對糖尿病大鼠成骨細胞結構的影響[J].時珍國醫國藥,2016,27(9):2065-2067.

[7] 張 燕,楊秋萍,趙 燕,等.2型糖尿病大鼠骨質疏松模型的建立[J].中國組織工程研究,2016,20(40):6041-6047.

[8] 沈繼平,何曉燁,胡 予.高能高脂與限能高脂飲食對大鼠糖脂代謝及胰腺β細胞的影響[J].復旦學報:醫學版,2013,40(3):339-344.

[9] 黃武維,楊 琳.電針結合補腎健脾方對老年骨質疏松患者骨密度及血鈣和血清OPN水平的影響[J].陜西中醫,2016,37(4):481-483.

[10] 程 斌,張莉莉,張 昕,等.針刺夾脊穴對糖尿病大鼠骨質疏松的作用[J].中華中醫藥學刊,2016,34(9):2101-2103.

[11] 上官文姬,李 鶴,湯璐敏.骨碎補總黃酮對大鼠成骨細胞VEGF和FGF-2表達的影響[J].遼寧中醫藥大學學報,2014,16(8):38.

[12] 李玲慧,詹紅生,丁道芳,等.溫腎陽、滋腎陰中藥復方對大鼠成骨細胞活性及Wnt/β-catenin通路影響的差異[J].中華中醫藥雜志,2015,30(1):70.

[13] 王 芳,高 英,李衛民,等.黃芪散對糖尿病大鼠股骨和脛骨的作用研究[J].中國骨質疏松雜志,2016,22(6):278-282,287.

[14] 陳郭勛,王明潮,許長鵬,等.中醫藥治療糖尿病性骨質疏松癥研究進展[J].河北中醫,2017,39(6):941-944.

[15] 黃丹萍.綜合治療內分泌失調性骨質疏松癥的臨床療效[J].遼寧醫學雜志,2016,30(1):64-66.