酶法輔助提取黑果枸杞花色苷工藝優化

鄭覃，王青霞，李建穎

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是一種枸杞屬（Lycium）茄科（Solanceae）的多年生灌木野生荒漠植物。黑果枸杞果實在成熟后呈近球形，為藍紫色，富含花色苷類色素，遠遠高于其他有色果實[1]。花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結合而成的一類化合物，是一種天然的抗氧化劑[2]，其抗氧化活性遠強于維生素C、維生素E等[3-4]，因其結構上含有的眾多酚羥基能夠阻斷自由基鏈式反應，從而有效清除活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）[5-6]。目前國內研究大多采用溶劑提取的方法對黑果枸杞中的花色苷進行提取[7]，采用生物酶輔助提取黑果枸杞花色苷的研究還相對較少。由于花色苷存在于細胞內或吸附在由纖維素組成的細胞壁上，常規方法提取花色苷很難獲得較高的提取率，果膠酶可以破壞細胞壁，使花色苷得到充分的釋放[8]，且生物酶的反應條件相對溫和，更加有助于花色苷這種光敏、熱敏性物質的提取[9-12]。本試驗采用果膠酶輔助乙醇提取黑果枸杞中花色苷，在單因素的基礎上，利用響應面試驗設計，優化出最佳提取工藝條件，這對黑果枸杞花色苷的開發利用及工業化生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

黑果枸杞干果：甘肅省民勤縣；果膠酶（酶活力500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；乙醇（AR）：天津市凱通化學試劑有限公司；鹽酸（AR）：天津市風船化學試劑科技有限公司；冰乙酸（AR）：天津大學科威公司；醋酸鈉（AR）：天津市德恩化學試劑有限公司；氯化鉀（AR）：天津光復科技發展有限公司。

1.1.2 儀器

BSA224S-CW分析天平、PB-10pH計：德國Sartorius；RV10DIGITAL 旋轉蒸發儀：德國 IKA；UV-2600紫外可見分光光度計：日本Shimadzu；Spex 6875冷凍研磨儀：美國Spex；Heraguard ECO超凈工作臺：美國Thermo；DK-8AS電熱恒溫水浴鍋、DH-101電熱鼓風干燥箱：上海精密科學儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵：鄭州長城科技工貿有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

將黑果枸杞摘去葉子，放入35℃干燥箱中烘干40 min，黑果枸杞干粉是通過將黑果枸杞干果粉碎得到，粉碎工藝為：溫度嚴格控制在20℃以內，每次粉碎時間為0.5 min，相鄰兩次粉碎時間間隔為5 min，粉碎3次，之后過30目篩。

1.2.2 緩沖液的配置

pH 1.0 的緩沖溶液：0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67，體積比；pH 4.5 的緩沖溶液：0.2 mol/L NaAc·3H2O∶0.2 mol/L HAc=1∶1，體積比。

1.2.3 總花色苷提取工藝

準確稱取0.500 0 g黑果枸杞干粉，按一定料液比加入蒸餾水中，復水30 min，加入0.10%果膠酶，用醋酸鈉緩沖液調節pH值至3.0，充分混合，于40℃水浴中進行酶解反應2 h，4 000 r/min，離心15 min，取上清液。濾渣按液料比20∶1（mL/g），加入80%體積濃度的乙醇溶液，在50℃條件下水浴回流提取1 h，4 000 r/min，離心15 min，與酶解后得到的上清液合并，即得提取液。

1.2.4 總花色苷含量測定

用pH試差法，以錦葵色素-3-葡萄糖苷為計量標準，測定總花色苷含量。

將提取液轉移至100.0 mL容量瓶內，用乙醇定容，再分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖液稀釋10倍，混勻后，放入40℃水浴中靜置平衡40 min。對照組將乙醇用pH 1.0和pH 4.5緩沖液稀釋10倍，混合均勻后放入40℃水浴中平衡40 min，平衡結束后，測其在530 nm和700 nm處的吸光度A530和A700。按下式計算總花色苷含量[13-14]：

式中：Mw為錦葵色素-3-葡萄糖苷的相對分子質量，493 200 mg/mol；DF為稀釋因子；V為提取液的體積，0.1 L；ε為摩爾消光系數，29 600 L/（mol·cm）；L為光程厘米數，1 cm；m為原料的質量，0.500 0 g。

1.2.5 單因素試驗

按照1.2.3所述花色苷提取工藝，分別研究在提取時間 1 h、乙醇濃度 80%、液料比 20∶1（mL/g）、提取溫度50℃和加酶量0.10%條件下，改變其中單一因素對花色苷提取率（以花色苷含量表示）的影響，單因素試驗水平如下：提取時間 0.5、1、1.5、2、2.5 h，乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%，液料比 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g），提取溫度 30、40、50、60、70 ℃，加酶量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%。每個單因素試驗平行重復3次，結果取平均值。

1.2.6 響應面優化試驗

根據響應面的設計原理，綜合單因素試驗結果（加酶量0.10%），選取提取時間、乙醇濃度、液料比和提取溫度4個因素，以花色苷提取率作為響應值，設計響應面試驗[15-17]。因素水平表見表1。

表1 試驗因素水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.7 數據處理

作圖采用Origin8.0軟件，采用Design-Expert 8.0軟件對響應面試驗數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對花色苷提取效果的影響

提取時間對黑果枸杞花色苷提取率的影響如圖1所示。

從圖1可以得出，隨著提取過程的不斷進行，花色苷的提取率開始有所增加。但當時間超過1 h后，花色苷的提取率呈明顯下降的趨勢，一方面是由于提取時間過長，氧化或光照作用會導致花色苷發生分解，使其提取率降低；另一方面是由于提取時間過長導致其它非花色苷成分大量溶出，從而使得提取率降低。所以最佳提取時間為1 h。

圖1 提取時間對花色苷提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction time on the anthocyanins extraction

2.1.2 乙醇濃度對花色苷提取效果的影響

乙醇濃度對黑果枸杞花色苷提取的影響如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對花色苷提取效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the anthocyanins extraction

由圖2可知，隨著乙醇濃度的不斷增高，黑果枸杞花色苷的提取率逐漸上升，說明在一定范圍內，隨著乙醇濃度的增加，溶劑的滲透力也隨之增加，從而有利于花色苷的溶出，但當乙醇濃度過高時，溶液的極性降低不利于極性的花色苷的溶出。所以80%的乙醇為最佳提取劑。

2.1.3 液料比對花色苷提取效果的影響

液料比對黑果枸杞提取效果的影響如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著液料比的逐漸增加，黑果枸杞花色苷的提取率逐漸上升后趨于平穩，原因是溶劑在一定范圍內能較為充分的提取花色苷，若進一步增加液料比，對其影響不大，且成本會增大，所以最佳液料比為 20∶1（mL/g）。

圖3 液料比對花色苷提取效果的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the anthocyanins extraction

圖4 提取溫度對花色苷提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the anthocyanins extraction

圖5 加酶量對花色苷提取效果的影響Fig.5 Effect of enzyme dose on the anthocyanins extraction

2.1.4 提取溫度對花色苷提取效果的影響

提取溫度對花色苷提取效果的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著溫度的升高，花色苷的提取率開始上升。由分子運動論可知，溫度升高會使分子運動加快，溶解和擴散的速度也隨之加快，溫度較高可能會使細胞膜結構發生變化，更易使花色苷被釋放到溶劑中，從而使其花色苷的提取率逐漸上升。但溫度到達50℃以后，花色苷的提取效果明顯下降。可能是由于溫度過高產生的強氧化作用使部分花色苷的結構遭到破壞，最終使得提取效果降低，所以50℃為最佳提取溫度。

2.1.5 加酶量對花色苷提取效果的影響

加酶量對花色苷提取效果的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著加酶量的增大，花色苷的提取率也在逐漸上升。由于黑果枸杞細胞壁主要成分為果膠和纖維素，但果膠所占比例較大，所以提取時所加果膠酶的量越多，更有利于花色苷被釋放到溶劑中。但加酶量超過0.10%之后，花色苷的提取效果明顯降低。是由于過量的果膠酶能夠使花色苷中的糖苷鍵水解斷裂[18]，使部分花色苷的結構遭到破壞，最終使得提取效果降低，所以0.10%為最佳加酶量。

2.2 響應面試驗結果

響應面試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Result of response surface test

根據試驗結果經回歸擬合后，得到黑果枸杞花色苷提取率對各試驗因子的二次多項回歸方程為：

各因素對響應值的影響程度可以由此方程中各項系數的絕對值的大小直接反映，系數的正、負決定了影響的方向。因為此方程中的平方項系數是負的，可以知道方程所對應的是開口向下的拋物面，所以最高點即為極大值點，能夠進行優化分析。回歸方程中一次項系數的大小比較之后得出結論，上述試驗中影響黑果枸杞中花色苷提取效果因素的重要程度順序為：D（提取溫度）＞B（乙醇濃度）＞A（提取時間）＞C（液料比）。

為進一步對得到的回歸方程進行顯著性檢驗，使用Design-Expert 8.0軟件對其進行方差分析[19-20]，見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由方差分析可知，模型（p＜0.0001）是有意義的：失擬項（p=0.4840＞0.05）不顯著，表明模型和實際情況擬合較好：矯正R2=0.9511表明該模型能夠說明95.11%響應值的變化。一次項B、D顯著，A、C不顯著，AD交互項影響顯著，其他交互項不顯著，二次項 A2、B2、C2、D2影響極其顯著。圖6為回歸模型中提取溫度—提取時間的交互作用的響應曲面圖，其他交互項類似，但影響不顯著。

圖6 提取溫度與提取時間對花色苷含量的交互作用Fig.6 Effect of interaction between extraction time and extraction temperature on the anthocyanin content

2.3 最佳提取工藝的預測及驗證

應用Design-Expert 8.0求解經過優化的回歸方程，在試驗范圍內可以得出，當加酶量為0.10%時，提取花色苷的最佳條件：提取時間1.047 h，乙醇濃度80.55%，液料比 20.72∶1（mL/g），提取溫度 49.22 ℃，此條件下理論值可達到24.7115 mg/g。考慮到實際試驗條件的精度，將其校正為：提取時間1.05 h，乙醇濃度80%，液料比 21∶1（mL/g），提取溫度 49 ℃，在此條件下進行3組平行試驗，提取得到的花色苷含量為（24.675±0.027）mg/g，結果與預測值基本相符，證明了該模型的有效性。

3 結論與討論

本試驗對果膠酶輔助乙醇提取黑果枸杞中花色苷進行了單因素試驗，各因素對花色苷提取效果的影響依次為：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間＞液料比；并進一步優化出最佳工藝條件，在加酶量為0.10%條件下，提取時間1.05 h，乙醇濃度 80%，液料比 21∶1（mL/g），提取溫度49℃時提取得到黑果枸杞花色苷含量為（24.675 ±0.027）mg/g。

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