阿維菌素、埃比菌素的殘留檢測

陳吉香，謝體波，馮才偉

（貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州貴陽550009）

阿維菌素是一種高效、廣譜的抗生素類藥物，由鏈霉菌中灰色鏈霉菌發酵產生，由一組大環內酯類化合物組成。阿維菌素類藥物主要包括阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素等物質[1]，是一種優良的新型農畜兩用抗生素[2-3]，其作用機制獨特，使用方便，被譽為近幾十年來抗寄生蟲藥物研究進展的重大突破。該物質殺蟲活性強，抗菌面廣[4]，廣泛用于蔬菜、水果、煙草等作物。但在動物體內殘留時間長，被世界衛生組織列為高毒化合物[5-6]。具有神經毒性和免疫毒性，多見為中樞神經系統損害[7-8]，大劑量可引起人或動物昏迷乃至死亡[9]。

目前，阿維菌素類藥物在蔬菜中的殘留分析方法主要是液相色譜法和液相色譜—串聯質譜法等儀器分析方法，但儀器法樣品前處理復雜，檢測時間長，儀器昂貴，成本較高[10-12]。

該研究采用間接競爭酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorlent assay，ELISA）方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，留的阿維菌素類藥物與酶標板上的偶聯抗原競爭阿維菌素抗體，加入酶標二抗后，用 3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（3，3'，5，5'-Tetrarnethy lbenzidinep，TMB）底物顯色，終止液終止反應，用酶標儀在450 nm處測定吸光度，樣本吸光度值與其所含阿維菌素類藥物殘留量成負相關，與標準曲線比較，再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出阿維菌素類藥物殘留含量。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

新鮮蔬菜：白菜、胡蘿卜；干菜和高淀粉含量樣品：干洋蔥、土豆；均屬市售。

阿維菌素標準品（純度≥99%）、埃比菌素標準品（純度≥99%）：上海安譜科學儀器有限公司；甲醇、乙腈、無水硫酸鈉、堿性氧化鋁（100目～200目）、正己烷，均為分析純：貴陽誠承化工設備有限公司；去離子水；阿維菌素類藥物快速檢測試劑盒產品[全套產品包括：96孔酶標板1塊（包被有偶聯抗原）、標準品6瓶：1 mL/瓶（0、0.5 、1.5、4.5 、13.5、40.5 μg/mL）、高濃度標準品：1 mL/瓶（1 mg/L）、酶標二抗 12 mL（紅色帽）、抗體工作液10 mL（綠色帽）、底物液A液7 mL（白色帽）、底物液B液7 mL（紅色帽）、終止液7 mL（黃色帽）、20×濃縮洗滌液40 mL（透明帽）、2×濃縮復溶液50 mL（藍色帽）]：北京勤邦生物技術有限公司。

配液1：復溶工作液

用去離子水將2×濃縮復溶液1∶1（體積比）進行稀釋（1份+1份去離子水）用于樣本的復溶。

配液2：洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液1∶19（體積比）進行稀釋（1份+19份去離子水）用于酶標板的洗滌。

1.1.2 儀器與設備

S7-360微孔板酶標儀（450/630 nm）：上海科華生物工程股份有限公司；EV311旋轉蒸發儀/Kwin6800氮氣吹干裝置：北京萊伯泰科儀器有限公司；FJ-200均質器：常州國宇儀器制造有限公司；HY-2振蕩器：常州國華電器有限公司；GZ-21M離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；QL-901渦旋儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；JY2002天平（感量0.01 g）：上海恒平科學儀器有限公司；10 mL刻度移液管、洗耳球、10 mL玻璃試管、2、50mL聚苯乙烯離心管：貴陽誠承化工設備有限公司；單道 20 μL～200 μL 微量移液器、100 μL～1 000 μL微量移液器、多道250 μL微量移液器：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 新鮮蔬菜：白菜、胡蘿卜

1）用均質器均質蔬菜樣本：

2）稱取（1.0±0.05）g均質后的組織樣本至 50 mL聚苯乙烯離心管中，加入5 mL正己烷，用振蕩器震動10 min，3 000 g以上，15℃（59℉）離心10 min；

3）取1 mL上層清液至10 mL潔凈干燥玻璃試管中，于50℃～60℃（122℉～140℉）水浴氮氣流下吹干；

4）加入1 mL復溶工作液（見配液1），用渦旋儀渦動30 s以上，超聲10 min，再用渦旋儀渦動30 s，混勻：

5）取 20 μL 用于分析。

1.2.1.2 樣品（干洋蔥、土豆）

1）用均質器均質蔬菜樣本；

2）稱取（1.0±0.05）g均質后的組織樣本至 50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6 mL去離子水，充分混勻，再加入5 mL正己烷，用振蕩器震動10 min，3 000 g以上，15℃（59℉）離心10 min；

3）取1 mL上層清液至10 mL潔凈干燥玻璃試管中，于50℃～60℃（122℉～140℉）水浴氮氣流下吹干；

4）加入1 mL復溶工作液，必須用渦旋儀渦動30 s以上，超聲10 min，再用渦旋儀渦動30 s，混勻；

5）取 20 μL 用于分析。

1.2.2 樣品檢測

1）將所需試劑從冷藏環境中取出，使用之前將模具內所有試劑與酶標板放實驗桌上回溫至室溫（20℃～25℃/68℉～77℉），將每種液體試劑搖勻；

2）取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放回鋁箔袋重新真空密封，保存于2℃～8℃（36℉～46℉）環境中；

3）編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置；

4）加標準品/樣本和抗體工作液：加入標準品/樣本20 μL到對應的微孔中，然后加入抗體工作液80 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃（98.6℉）避光環境中反應30 min；

5）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液（見配液2）250 μL/孔，充分洗滌4次～5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）；

6）加酶標二抗：加入酶標二抗 100 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃（98.6℉）避光環境中反應30 min，取出重復洗板步驟5；

7）顯色：加入底物液 A 液 50 μL/孔，再加入底物液B液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃（98.6℉）避光環境中顯色15 min；

8）測定：加入終止液 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處測定每孔OD值（在5 min內讀完）。

2 試劑盒相關指標檢測方法

分別對試劑盒的特異性、檢測限、精密度、準確度進行試驗，并將其中檢測限、精密度和準確度與儀器方法檢測的檢測限、精密度和準確度進行對比。

2.1 線性關系

標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

式中：B為標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值；B0為0 μg/L標準溶液的平均吸光度值。

分別測定阿維菌素和埃比菌素 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/kg 6個濃度的標準液的吸光度值（A）。求出其濃度對數值（y）和對應濃度的百分吸光率（x）的線性關系。結果顯示如表1。

表1 藥物標準曲線方程Table 1 Equation of standard curve of drugs

阿維菌素標準曲線回歸方程為：y=-2.210x+1.524，相關系數為R2=0.999，埃比菌素中標準曲線回歸方程為：y=-0.750x+0.273，相關系數為R2=0.999，說明試劑盒線性關系良好。

將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中阿維菌素類藥物的實際濃度。其中，新鮮蔬菜樣本、干菜和高淀粉樣本的稀釋倍數均為5倍。

2.2 試劑盒特異性的測定結果

特異性用交叉反應率來表示，交叉反應率是指抗體與結構不同的抗原決定簇發生結合的能力。交叉反應率小，可證明抗體的特異性高。選擇與阿維菌素類似結構和類似功能的3種藥物，將不同濃度的阿維菌素類似物，替代阿維菌素標準溶液，測定其標準曲線，并計算IC50抑制濃度，并根據各藥物的IC50抑制濃度計算交叉反應率。結果顯示如表2。

表2 交叉反應率Table 2 Cross response rate

該酶聯免疫試劑盒對阿維菌素類藥物類似物生物交叉反應率均較低，具有良好的特異性。

2.3 試劑盒檢測限的測定結果

分別對20份白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆樣本進行檢測，計算阿維菌素類藥物的濃度，測定結果的平均值加上3倍標準差為試劑盒的實際樣品的最低檢測限。結果顯示如表3，該酶聯免疫試劑盒對白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆中阿維菌素和埃比菌素的檢測限均為 3 μg/kg。

表3 試劑盒最低檢測限Table 3 Minimum detection limit of kit

續表3 試劑盒最低檢測限Continue table 3 Minimum detection limit of kit

表4 試劑盒準確度檢測結果Table 4 Accuracy test results of kit%

表5 試劑盒精密度檢測結果Table 5 Precision test results of kit%

2.4 試劑盒精密度和準確度測定結果

精密度又稱可重復性，反應測定方法對某一特定樣品多次測定所得結果的重復程度，這是評價酶聯免疫試劑盒質量的最基本參數，常用變異系數表示。準確度是指測定值與真實值間的符合程度，試劑盒的準確度常用回收率表示。

在檢測為陰性的白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆樣本中分別添加 5、10 μg/kg 和 20 μg/kg 阿維菌素、埃比菌素，每種樣品、每個濃度各6個平行，用試劑盒提供的操作方法提取測定。分別測定計算樣品的回收率及變異系數。結果顯示如表4、表5，對于阿維菌素，4種樣品平均回收率均在92.0%～99.6%之間，對于埃比菌素，4種樣品平均回收率均在91.3%～100.1%之間，批內和批間變異系數均小于10%，說明該酶聯免疫試劑盒具備較高的精密度和準確度。

表6 試劑盒與儀器檢測方法比較Table 6 Comparison of kit and instrument detection method

2.5 試劑盒與儀器方法檢測結果比較

隨機抽取市場上售賣的白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆樣本各80份，分別用試劑盒和儀器方法進行檢測。儀器方法參考GB 23200.20-2016《食品安全國家標準食品中阿維菌素殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法》。

儀器方法中阿維菌素與埃比菌素的檢測限為5 μg/kg，以此為陽性判定線，高于或等于陽性判定線的值以實際值表示。結果顯示如表6，公司自主研制的阿維菌素三合一酶聯免疫試劑盒檢測結果與儀器檢測結果相吻合，表明這試劑盒的準確度達到國家標準檢測水平。

3 結論與討論

本文對自主研發的阿維菌素三合一酶聯免疫試劑盒的特異性、檢測限、精密度和準確度進行研究，并對白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆4種樣品中阿維菌素類藥物的殘留量進行檢測，將其檢測結果與儀器方法相比較。結果表明，阿維菌素三合一酶聯免疫試劑盒特異性強、靈敏度高，對白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆4種樣品的最低檢測限為3 μg/kg：阿維菌素測定時4種樣品平均回收率在92.0%～99.6%之間，埃比菌素測定時4種樣品平均回收率在91.3%～100.1%之間，批內和批間變異系數均小于10%，說明該酶聯免疫試劑盒具備較高的精密度和準確度；其對市售白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆4種樣品的檢測結果與儀器檢測結果相吻合，說明該試劑盒達到國家標準檢測水平，且分析周期短，樣品前處理方法簡單，操作方便，檢測設備投入少，耗能低，可實現對蔬菜中殘留阿維菌素類藥物的快速檢測。

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