拆分網絡分析22株蛹蟲草親緣關系及高產蟲草素菌株初篩

劉建兵 戚夢 杜苑如 傅俊生 胡開輝

（福建農林大學生命科學學院生物工程系，福州 350002）

蛹蟲草Cordyceps militaris（L.）Fr.俗稱北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草等，屬子囊菌門Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麥角菌科Clavicipitaceae、蟲草屬Cordyceps，在自然界中分布廣泛［1］。其子實體和發酵產物中均含有豐富的蟲草素、蟲草酸、腺苷及多糖等活性成分，具有抗菌、消炎、抗腫瘤、降血糖及調節人體免疫功能等作用，在我國作為食藥用真菌而廣泛應用［2］。但目前蛹蟲草產業存在著很多問題，尤其是缺乏優質菌種、菌種易退化以及“同種異名”或“同名異種”現象嚴重等問題是制約蛹蟲草產業化的重要瓶頸。應對這些問題的主要手段是重新分離野生菌株以及進行人工育種，雜交育種是最重要的育種方法之一［3］。在進行雜交育種之前，充分認識親本菌株間的親緣關系是必要的，限制性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態性DNA（RAPD）、簡單重復間序列（ISSR）及rDNA ITS序列是研究蛹蟲草親緣關系最常見的幾種分子標記方法［4-5］。其中rDNA ITS序列因其應用廣泛及操作簡便等優點而備受研究者的喜愛，并且ITS序列分析可以比較序列中單堿基的變化，是研究真菌遺傳變異最靈敏的方法之一，所以常用來研究真菌種內的親緣關系及遺傳分化［6］。但諸多研究表明［7-8］，ITS序列在蛹蟲草種內的變異率比較低，用傳統的系統發育樹很難分析種內的聚類情況及親緣關系，所以建立一種基于ITS序列直觀地分析蛹蟲草種內聚類情況及親緣關系的方法具有重要意義。

蟲草素cordycepin最初是從蛹蟲草中分離出來的核苷類抗菌素，也是我國傳統名貴中藥材蛹蟲草和冬蟲夏草的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗菌、抗衰老、免疫調節和清除體內自由基等多種藥理作用，所以蟲草素可作為評價菌種質量的重要指標［1，9］。基于此，本研究采用ITS序列對22株蛹蟲草行分類鑒定，用拆分網絡法研究蛹蟲草種內的聚類情況，并比較供試菌株發酵產蟲草素能力，為蛹蟲草菌株質量監測和菌種鑒定提供快速有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所用的蛹蟲草菌株共22株（表1）。

表1 供試菌株

1.2 方法

1.2.1 菌株基因組DNA提取、ITS區擴增及測序 將活化的菌株以打孔法接種到液體培養基（葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母膏2 g，H2PO41.5 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，水 1 L）中，25℃、160 r/min培養6 d后，過濾收集菌絲。菌絲使用液氮研磨，并按照OMEGA真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，再按照Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix試劑盒說明擴增ITS區序列，引物采用真菌核糖體基因間隔區通用ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'） 和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。反應條件：95℃ 2 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，28個循環；72℃ 10 min。擴增樣品經1%瓊脂糖膠檢測后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.2 ITS序列分析 將序列在GenBank 數據庫中注冊獲得登錄號。利用NCBI中的BLAST對DNA序列進行比對分析；用DNAMAN V6軟件統計序列長度、GC含量；用系統發育分析軟件 MEGA6.0軟件的ClustalW功能進行序列比對，并統計序列的變異情況；采用Splits Tree 4構建折分網絡圖，運行條件為默認設置。

1.2.3 蟲草素含量檢測 將活化的菌株以打孔法接種到液體培養基中，250 mL三角瓶裝100 mL培養基，25℃、160 r/min培養13 d后，抽濾分離發酵液和菌絲；HPLC法測搖瓶發酵液及菌絲體中蟲草素含量，發酵液過0.22 μm濾膜后上機檢測，菌絲體烘干后粉碎，加水超聲浸提，料液比1∶80（g：mL），離心取上清過濾膜，后上機檢測蟲草素含量；色譜條件：島津ODS-2 C18 色譜柱，流動相為甲醇∶水=15∶85，流速1 mL/min，柱溫25℃，檢測波長260 nm，進樣10 μL。

1.2.4 統計學分析 采用 SPSS 23.0 統計軟件包進行數據處理，不同處理組間比較采用one-way ANOVA檢驗，實驗數據以x-±s表示，P＜ 0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 供試蛹蟲草菌株的ITS序列差異

測序結果（表2）表明，22供試的株蛹蟲草ITS序列長度在518-539 bp之間，相差21 bp；G+C含量差異較小，從56.42%到57.54%。根據GenBank中已有的蛹蟲草ITS序列信息，確定供試樣品ITS序列的ITS1、5.8S及ITS2區域，去除18S和26S區引物端序列后，將供試菌株及外類群 ITS序列對位排列（圖1），分析菌株間ITS序列的變異情況，共有39個差異位點（Variable sites），其中簡約信息（Parsimony informative，PI）位點有12個，而序列的差異主要來源于ITS1區，5.8S區和ITS2區在供試蛹蟲草菌株間沒有堿基差異。

2.2 拆分網絡法分析22株蛹蟲草的親緣關系

基于上述ITS序列的分析，拆分網絡分析22株蛹蟲草菌株間的親緣關系（圖2）表明，22株蛹蟲草聚為了三個類群。

第一類群由9株（MF1、5、15、17、18、19、27、28、29）蛹蟲草組成，以其特有的第6位點（Site6）位點處的堿基替換而區別于其他菌株，在這個信息位點中既發生了堿基的轉換（transition）又發生了堿基的顛換（transversion），這個類群菌株在此位點發生了G-T或A-T間的顛換，而顛換所占的權重（處理DNA序列時）要大于轉換，所以在拆分網絡上形成了一個分裂；并且在這9個菌株中，MF5、19、27由于在第11位點（Site11）處發生的A-C堿基的顛換，而顯示了較近的親緣關系。

表2 供試菌株r DNA-ITS區序列信息

第二類群由菌株MF2、4、6、8、16、20、24、25、26組成，因共同表現在第8位點（Site8）和第17位點（Site17）處發生的堿基替換而形成親緣關系較近的類群，明顯區別于其它菌株，此外菌株MF2、25、26以及MF4、6因ITS序列100%的相似度而處于相同的系統位置。

第三個類群的4個菌株（MF21、22、23、30）均來源于江蘇，因第8位點的堿基顛換而形成一個小分支，表現為親緣關系較近，可能為“同種異名”菌株。

2.3 供試蛹蟲草菌株液體發酵產蟲草素能力

蟲草素是蛹蟲草的主要活性成分之一，也是作為評價產品品質優劣的主要指標，所以篩選出高產蟲草素的菌株對生產具有實際意義的。從圖3可以看出，蟲草素的出峰時間為16.02 min左右，發酵液及菌絲體中的蟲草素能夠很好的被分離開。從表3可以看出，不同菌株間產蟲草素能力相差很大，且蛹蟲草的液體發酵物中胞外液占主要體積，而胞外液中都有較高蟲草素含量，所以可以看出蛹蟲草在液體發酵過程中，蟲草素主要存在于胞外液中；從胞外液中蟲草素含量來看，MF27產量最高，含量達到332.74 mg/L，是含量最低菌株MF25的31倍，且顯著的高于其它菌株（P＜0.05），這為后續的優良菌株選育，以及優良菌株的推廣奠定了良好基礎。

圖1 供試菌株ITS序列變異位點分析

圖2 基于ITS序列構建的拆分網絡

3 討論

圖3 蟲草素標準品（A）和MF27蟲草胞外液（B）HPLC分析圖譜

表3 供試菌株液體發酵產蟲草素能力比較

本文利用拆分網絡法，基于ITS序列分析22株蛹蟲草的親緣關系，結果在拆分網絡上聚類為3個類群，發現每個類群因其特有的堿基替換而區別于其他菌株，較直觀地展示了菌株間的親緣關系。拆分網絡splits networks法［10-12］是系統發育網絡phylogenetic networks分析中常用的方法之一，能用以描述數據集中沖突的、模糊不清的信號，檢測一些細微的差異，能提供一個二叉進化樹不能展示的、被掩蓋了的平行事件，不確定的系統發育關系進化圖像。由于拆分網絡的優越性，使得其得到了越來越廣泛的應用和認可。胡春云［13］分別應用簡約法系統樹和NeighborNet系統發育網絡，基于cpDNA序列分析梨屬植物系統發育關系，發現NeighborNet能解釋系統發育樹上低支持率現象是由沖突的信和信息位點不足引起的，能更好地分析種群的演化。梁宗琦［10］和周葉鳴等［14］研究表示拆分網絡配合系統發育樹能更清楚地解釋物種之間的進化關系，且拆分網絡更適合分析親緣關系較近的物種間的遺傳分化。

蟲草素最早是從蛹蟲草中分離出來的，所以又被稱作蛹蟲草菌素、蟲草菌素，是蛹蟲草中標志性的活性成分［15］。馮德龍等［16］以19株蛹蟲草為研究材料，CYM 液體培養基25℃搖瓶培養 20 d后用HPLC法檢測各菌株發酵液的蟲草素含量，結果蟲草素積累量最高的達到126.33 mg/L；王蕾等［17］從14株蛹擬青霉菌株Paecilomyces militarisZ.Q. Liang中篩選到CM001菌株的蟲草素產量最高，達到73.81 mg/L。本文以液體發酵產蟲草素能力為指標評價菌株的品質特性，結果顯示MF27發酵液蟲草素含量達到332.74 mg/L，是含量最低菌株MF25的31倍，且顯著高于其它菌株（P＜0.05），可見MF27具有一定的推廣應用價值。

4 結論

本文建立了基于rDNA ITS序列，利用拆分網絡分析蛹蟲草親緣關系的方法，并篩選出高產蟲草素菌株，MF27的發酵液中蟲草素含量為332.74 mg/L，顯著高于其它菌株（P＜0.05）。本研究為分析蛹蟲草菌株間的親緣關系提供了科學方法。

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